薏米蛋白提取方法比較研究

曹向宇，劉劍利*，蘆秀麗，李其久，侯 瀟

(遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

薏米蛋白提取方法比較研究

曹向宇，劉劍利*，蘆秀麗，李其久，侯 瀟

(遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

利用堿法和鹽法提取薏米蛋白質(zhì)，對薏米蛋白提取方法進(jìn)行優(yōu)選。以蛋白提取率為指標(biāo)，堿法以提取液pH值、料液比、提取溫度及提取時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，鹽法以鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度及提取時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)；通過L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件，并對提取方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明：堿法優(yōu)于鹽法，堿法最佳提取條件為料液比1:12(g/mL)、提取溫度35℃、提取時(shí)間5h、pH11，在此條件下，蛋白質(zhì)的提取率可達(dá)43.56%。

薏米；蛋白質(zhì)；提取

薏米又稱薏苡仁、薏仁米、藥玉米等，是禾本科植物薏苡(Coix lachry-majobi L.)的成熟種仁，是我國最古老作物之一。薏米在我國大部分地區(qū)都有種植，主要產(chǎn)于福建、遼寧、河北、廣東、海南等地。薏米不僅營養(yǎng)成分全面，含蛋白質(zhì)18%～21%，脂肪4%～6%、碳水化合物79.2%，還含有人體所需18種氨基酸，多種維生素和礦物質(zhì)，并且營養(yǎng)價(jià)值非常高，在禾本科植物中位居第一，有著“世界禾本科植物之王”的美譽(yù)[1]。

目前，國內(nèi)外對薏米資源的研究與開發(fā)極為重視，但研究主要集中于薏苡仁酯、多糖、薏苡仁油等成分的提取工藝和生物學(xué)功能研究上，對薏米蛋白提取的研究卻相對較少[2-11]。遼寧薏米資源豐富，特別是遼寧臺安、盤錦等地區(qū)盛產(chǎn)薏米，質(zhì)量好、產(chǎn)量高，但目前尚未充分開發(fā)利用[12]。薏米蛋白具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，可作為食品工業(yè)中的蛋白原料和蛋白質(zhì)強(qiáng)化劑，也可經(jīng)過酶解制備功能性多肽[13]。因此，薏米蛋白的研究開發(fā)非常有意義。并且研究薏米蛋白的提取工藝，提高薏米蛋白提取率，提升薏米的綜合利用率，對于充分利用薏米資源具有重要的意義。本研究采用堿法和鹽法兩種方法，通過單因素及正交試驗(yàn)就薏米蛋白提取工藝進(jìn)行比較，以期找到最佳的工藝參數(shù)，為薏米蛋白綜合利用和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米(產(chǎn)自遼寧臺安) 市售；考馬斯亮藍(lán)G250 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì) 德國Sartorius公司；SCR 20BC型高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；721型分光光度計(jì)上海第三分析儀器廠；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市城東科輝儀器廠；LNK-871型凱氏定氮儀 江蘇省宜興市科教儀器研究所。

1.3 方法

1.3.1 薏米主要成分分析

總蛋白含量測定：采用凱氏定氮法[14]；碳水化合物的測定：采用苯酚-硫酸法[15]；脂肪測定：按GB 5009.6—85《食品中脂肪的測定方法》進(jìn)行；灰分測定：按GB 5009.4—85《食品中灰分的測定方法》進(jìn)行[16]。

1.3.2 薏米蛋白提取工藝

薏米→粉碎→過篩(60目)→加堿液(或鹽液)→浸提→3500r/min離心分離→上清液(堿法樣品調(diào)pH值至7)→測蛋白質(zhì)濃度

1.3.3 薏米蛋白提取率的測定

提取液中蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[14]，堿法測定蛋白之前，將其pH值調(diào)整到7.0，迅速測定蛋白含量。

薏米蛋白提取率/%=(提取液中蛋白質(zhì)含量/薏米總蛋白含量)×100

1.3.4 堿法提取薏米蛋白

1.3.4.1 堿法提取單因素試驗(yàn)

以料液比(1:6、1:8、1:10、1:12、1:14)、溫度(30、35、40、45、50℃)、時(shí)間(1～5h)、pH(8～12)為單因素，在其他條件一定的前提下，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定正交試驗(yàn)的因素水平。

1.3.4.2 堿法提取正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)測定最佳提取條件，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。

1.3.5 鹽法提取薏米蛋白

1.3.5.1 鹽法提取單因素試驗(yàn)

以料液比(1:6、1:8、1:10、1:12、1:14)、溫度(30、35、40、45、50℃)、時(shí)間(1～5h)、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)為單因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定正交試驗(yàn)的因素水平。

1.3.5.2 鹽法提取正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)測定最佳提取條件，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有單因素及正交試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果均以x±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 薏米主要成分分析

經(jīng)分析薏米中蛋白質(zhì)含量18.6%、碳水化合物71.3%、脂肪6.8%、總灰分含量1.5%。

2.2 堿法提取蛋白

2.2.1 單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 料液比對薏米蛋白提取率的影響

圖1 料液比對薏米蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of Job, s Tears seed protein

由圖1可得，隨著堿液的不斷增加，薏米蛋白提取率逐漸上升，當(dāng)料液比達(dá)到1:12時(shí)，蛋白提取率最高，當(dāng)料液比繼續(xù)升高時(shí)，蛋白提取率基本穩(wěn)定，略有下降。料液比l:6時(shí)，蛋白提取率最小，這是因?yàn)榧铀刻?，蛋白質(zhì)不能充分溶解；料液比1:14時(shí)，蛋白提取率開始減小，可能是因?yàn)榧铀窟^大，沉淀效果差，損失增大，同時(shí)料液比過大，設(shè)備容積增大，能耗加大，成本增加。因此設(shè)定堿法提取薏米的最適合料液比為1:12。

2.2.1.2 提取溫度對薏米蛋白提取率的影響

圖2 提取溫度對薏米蛋白提取率的影響,Fig.2 Effects of temperature on extraction rate of Job s Tears seed protein

由圖2可得，在溫度較低的30℃時(shí)，薏米蛋白的提取率較低，但隨著溫度的升高，提取率曲線總體走勢呈先上升，后下降趨勢，在35℃時(shí)蛋白提取率最高，為32.15%，溫度繼續(xù)升高后，薏米蛋白的提取率有所下降，其原因可能是溫度過高，蛋白溶液的黏度變大，分子的運(yùn)動速度減慢[17]。而且，在長時(shí)間加熱的作用下蛋白質(zhì)易產(chǎn)生變性，導(dǎo)致蛋白提取率下降，故選定溫度為35℃。

2.2.1.3 提取時(shí)間對薏米蛋白提取率的影響

圖3 提取時(shí)間對薏米蛋白提取率的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction rate of Job s Tears seed protein

由圖3可以看出，提取時(shí)間1～2h時(shí)，由于提取時(shí)間較短，薏米不能與堿性物質(zhì)充分接觸，導(dǎo)致薏米蛋白不易與其他組分分開；當(dāng)提取時(shí)間為5h時(shí)，薏米蛋白提取率最高，但與4h相比沒有較大變化，從規(guī)?；a(chǎn)節(jié)約能源角度考慮故選取4h作為最佳提取時(shí)間。

2.2.1.4 pH值對薏米蛋白提取率的影響

圖4 pH值對薏米蛋白提取率的影響Fig.4 Effects of pH on extraction rate of Job s Tears seed protein

由圖4可以看出，在pH8時(shí)薏米蛋白的提取率較低，隨著pH值不斷增加，薏米蛋白的提取率也隨之增加，當(dāng)pH11時(shí)，薏米蛋白的提取率最高，pH12時(shí)，薏米蛋白的提取率有所下降，可能是pH值過高蛋白質(zhì)變性或降解[18]。

2.2.2 正交試驗(yàn)

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，堿法提蛋白最佳提取條件為料液比1:12、提取溫度35℃、提取時(shí)間4h、pH11，按表1進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表1 堿法提取薏米蛋白正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design for optimizing alkaline extraction of Job s Tears seed protein

表2 堿法提取薏米蛋白正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Scheme and experimental results of orthogonal array design for optimizing alkaline extraction of Job s Tears seed protein

由表2可得出，堿法提取薏米蛋白的影響因素為提取溫度＞料液比＞pH值＞提取時(shí)間。通過正交試驗(yàn)得出堿法提取薏米蛋白最佳提取條件為料液比1:12、提取溫度35℃、提取時(shí)間5h、pH11，在此條件下重復(fù)試驗(yàn)，測得蛋白提取率為43.56%。

2.3 鹽法提取蛋白

2.3.1 單因素試驗(yàn)

2.3.1.1 料液比對薏米蛋白提取率的影響

圖5 料液比對薏米蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of Job s Tears seed protein

由圖5分析可以看出在料液比1:6～1:12之間時(shí)，薏米蛋白提取率逐漸增加，但為1:12時(shí)薏米蛋白提取率最高，當(dāng)為1:14之后蛋白質(zhì)的提取率略有下降，其原因可能是當(dāng)料液比為1:6時(shí)，加水量太小，蛋白質(zhì)未充分溶解；料液比1:14時(shí)，蛋白提取率開始減小，這是因?yàn)榧铀窟^大，沉淀效果差，損失增大。所以鹽法提取薏米蛋白的料液比定為1:12。

2.3.1.2 提取溫度對薏米蛋白提取率的影響

由圖6可以看出，當(dāng)溫度低于40℃時(shí)，薏米蛋白提取率隨提取溫度的升高而增大，當(dāng)溫度到達(dá)40℃時(shí)，提取率最大，隨后降低，可能由于疏水基團(tuán)的暴露和展開，蛋白質(zhì)分子聚集，使蛋白質(zhì)溶解度下降，導(dǎo)致蛋白提取率下降[17]。因此，對于薏米蛋白的提取溫度不宜過高，以40℃為最佳提取溫度。

圖6 提取溫度對薏米蛋白提取率的影響Fig.6 Effects of temperature on extraction rate of Job s Tears seed protein

2.3.1.3 提取時(shí)間對薏米蛋白提取率的影響

圖7 提取時(shí)間對薏米蛋白提取率的影響Fig.7 Effects of extraction time on extraction rate of Job s Tears seed protein

由圖7可以得出，提取時(shí)間1～2h時(shí)，由于時(shí)間太短，蛋白質(zhì)不易與其他成分分離，從而蛋白質(zhì)提取率小，但隨著時(shí)間增大到3h時(shí)，蛋白提取率最大；隨著提取時(shí)間進(jìn)一步加長，薏米蛋白的提取率并沒有顯著增加，故提取時(shí)間選擇為3h。

2.3.1.4 鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對薏米蛋白提取率的影響

圖8 鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對薏米蛋白提取率的影響Fig.8 Effects of salt concentration on extraction rate of Job s Tears seed protein

由圖8可知，在鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%～2%之間時(shí)，蛋白提取率逐漸增加，但當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)蛋白提取率最高，當(dāng)為2.5%后蛋白質(zhì)的提取率逐漸下降。原因可能是較高的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)造成蛋白鹽析沉淀，使提取率下降，所以提取薏米蛋白的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。

2.3.2 正交試驗(yàn)

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，鹽法提取蛋白的最佳提取條件為料液比1:12、溫度40℃、時(shí)間3h、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%，在此基礎(chǔ)上按表3進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表3 鹽法提取蛋白L9(34)正交試驗(yàn)表Table 3 Factors and levels in orthogonal array design for optimizing salt extraction of Job s Tears seed protein

表4 鹽法提取蛋白正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Scheme and experimental results of orthogonal array design for optimizing salt extraction of Job s Tears seed protein

由表4可得出，鹽法提取薏米蛋白的決定因素為提取時(shí)間＞鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞料液比。通過正交試驗(yàn)得出鹽法提取薏米蛋白最佳提取條件為料液比1:11、溫度35℃、時(shí)間3h、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，測得蛋白提取率為29.51%。

3 結(jié) 論

3.1 堿法提取薏米蛋白最佳提取條件為料液比1:12、溫度35℃、時(shí)間5h、pH11，此提取條件下，薏米蛋白提取率可達(dá)43.56%。

3.2 鹽法提取薏米蛋白最佳提取條件為料液比1:11、溫度35℃、時(shí)間3h、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，此提取條件下，薏米蛋白的提取率可達(dá)29.51%。

3.3 比較兩種薏米蛋白提取方法可知，堿法提取薏米蛋白提取率較高，容易控制，操作簡單，便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，此法有望成為薏米深加工和綜合利用的一條主要途徑之一。

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Comparative Study on Methods for Extracting Protein from Job’s Tears Seed

CAO Xiang-yu，LIU Jian-li*，LU Xiu-li，LI Qi-jiu，HOU Xiao
(School of Life Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

Two extraction methods, namely alkaline method and salt method were used to extract protein from Job s Tears seeds,and their effects on the extraction rate of protein from Job, s Tears seed were compared. In the alkaline extraction method, the extraction parameters pH, material-to-liquid ratio, temperature and extrac,tion time were optimized by single factor and orthogonal array design methods based on the extraction rate of protein from Job s Tears seed. The extraction parameters optimized (also by single factor and orthogonal array design methods) in the salt extraction method were salt concentration, material-to-liquid ratio, temperature and extraction time. The results showed that the optimum material-to-liquid ratio, temperature, extraction time and pH for the alkaline extraction of Job, s Tears seed protein were 1:12, 35 ℃, 5 h and 11, respectively. Under these conditions, the extraction rate of protein was up to 43.56%. Overall, the alkaline extraction method was superior to the salt extraction method.

Job, s Tears seed；protein；extraction

TQ93

A

1002-6630(2011)08-0088-05

2010-07-15

遼寧省教育廳高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2009A811；L20100154)；遼寧省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2009209001)；遼寧大學(xué)“211工程”三期建設(shè)項(xiàng)目

曹向宇(1980—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：xiangyucao@yahoo.cn

*通信作者：劉劍利(1980—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：jianliliu@yahoo.com.cn