甘肅河西沙區(qū)鎖陽多糖提取工藝優(yōu)化及含量測定

羅光宏，王 勤*，祖廷勛，陳天仁

(1.河西學(xué)院凱源生物技術(shù)開發(fā)中心，甘肅省微藻工程技術(shù)研究中心，甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室，甘肅 張掖 734000；2.甘肅省張掖市藥品檢驗所，甘肅 張掖 734000)

甘肅河西沙區(qū)鎖陽多糖提取工藝優(yōu)化及含量測定

羅光宏1，王 勤2,*，祖廷勛1，陳天仁1

(1.河西學(xué)院凱源生物技術(shù)開發(fā)中心，甘肅省微藻工程技術(shù)研究中心，甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室，甘肅 張掖 734000；2.甘肅省張掖市藥品檢驗所，甘肅 張掖 734000)

采用水提醇沉法，利用L9(33)正交試驗優(yōu)選鎖陽多糖的提取工藝，用硫酸苯酚比色法對甘肅河西沙區(qū)不同地區(qū)鎖陽中多糖含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明：提取最佳工藝條件為料液比1:15(g/mL)、提取時間90min、提取次數(shù)為2次；甘肅河西沙區(qū)不同地區(qū)鎖陽多糖含量差別顯著。鎖陽多糖可作為控制鎖陽質(zhì)量的一項指標(biāo)性成分。

鎖陽；多糖；正交試驗；提取工藝；含量測定

鎖陽(Cynomorium songaricum Rupr.)俗稱“不老藥”，又名鐵棒槌、銹鐵棒、地毛球、羊鎖不拉、烏蘭高腰(蒙語)，為鎖陽科鎖陽屬多年生肉質(zhì)寄生草本植物，多寄生于蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺屬(Nityaria L.)植物根部，為全寄生種子植物[1]。主要分布于土壤缺乏有機(jī)質(zhì)而富含鹽分的荒漠沙區(qū)地帶，主產(chǎn)于甘肅、新疆、青海、寧夏、內(nèi)蒙古等地，其中尤其以甘肅河西走廊地區(qū)分布最廣[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，鎖陽具有促進(jìn)性功能和腎功能；耐缺氧、抗應(yīng)激、抗疲勞作用；清除體內(nèi)自由基、抗氧化、抗衰老作用；抑制血小板聚集；調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)；潤腸通便作用；抗癌及抑制艾滋病病毒增殖的等作用[3-9]。 鎖陽中含有的主要有效成分有以兒茶素為代表的黃酮類、原兒茶酸為代表的有機(jī)酸類、熊果酸為代表的三萜類、多糖與鞣質(zhì)等化合物[10-14]。其中，鎖陽多糖具有防癌、抗癌、提高機(jī)體免疫力、延緩衰老等作用，并對心血管系統(tǒng)有強(qiáng)心、降壓、保護(hù)心肌、抑制血栓形成和降血脂作用[15-17]。近年來，鎖陽的保健價值已被廣泛重視，并成為保健食品和藥品的新原料，具有一定開發(fā)潛力[18]。

本實驗以鎖陽多糖含量為考察指標(biāo)，采用L9(33)正交試驗法優(yōu)選鎖陽多糖的提取工藝，確定最佳提取條件，并對不同地區(qū)鎖陽中多糖含量進(jìn)行測定。通過研究認(rèn)為可以將多糖作為控制鎖陽藥材質(zhì)量的指標(biāo)性成分，為鎖陽優(yōu)質(zhì)藥材的選擇和綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎖陽原料采自或購于甘肅河西走廊各地，由蘭州大學(xué)藥學(xué)院馬志剛教授鑒定為Cynomorium songaricum Rupr.。

D-葡萄糖對照品(批號：110833-200904) 中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，含量以100%計(置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12h以上使用)；苯酚(AR)宜興市化學(xué)試劑廠有限公司；硫酸(AR) 西安化學(xué)試劑廠；無水乙醇(AR) 天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心；乙醇(AR) 天津市化學(xué)試劑二廠；乙醚(AR) 天津市百世化工有限公司；丙酮(AR) 西安市福晨化學(xué)試劑有限公司；五氧化二磷(AR) 天津市大茂化學(xué)試劑廠；實驗用水為超純水，由純水發(fā)生器制得。

1.2 儀器與設(shè)備

U-3900H型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Metler-D2025型十萬分之一電子天平 梅特勒儀器上海公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ型水循環(huán)式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司；DZF-6020型真空干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HHS-24型電熱恒溫水浴鍋 江蘇大地自動化儀器廠；PTHW型電熱套 鞏義市英峪予華儀器廠；信強(qiáng)牌多功能高速粉碎機(jī) 上海廣沙工貿(mào)有限公司；SB2200-T型超聲波提取器(輸入功率90W) 上海必能信超聲有限公司；UPS-Ⅱ型優(yōu)普UPS系列純水系統(tǒng) 成都超純科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鎖陽多糖樣品的提取制備

將采集的鎖陽材料分別清洗干凈，切塊，自然晾干，粉碎成粗粉，備用。具體方法是取鎖陽粗粉9份，每份約20g，分別用乙醇100mL回流提取2次，每次2h，除去單糖、低聚糖及苷類等干擾性成分后，殘渣按正交試驗方案提取，水提液濃縮至約30mL，加入乙醇，使含醇量達(dá)到80%，冰箱中放置過夜后離心，沉淀分別用無水乙醇、乙醚、丙酮依次洗滌，50℃減壓烘干，作為正交試驗樣品。

1.3.2 鎖陽多糖提取的單因素試驗

1.3.2.1 料液比對提取效果的影響

料液比分別為1:5、1:10、1:15、1:20、1:25(g/mL)，按照提取制備方法提取2次，每次90min，測定其多糖得率(mg/g)。

1.3.2.2 提取時間對提取效果的影響

在料液比為1:15(g/mL)的提取條件下，分別提取30、60、90、120、150min，分別提取2次，合并提取液，測定其多糖得率/(mg/g)。

1.3.2.3 提取次數(shù)對提取效果的影響

分別在料液比為1:15，每次90min的提取條件下進(jìn)行1、2、3、4、5次提取，合并提取液，測定其多糖得率(mg/g)。

1.3.3 鎖陽多糖提取工藝的正交試驗設(shè)計

采用硫酸苯酚比色法[19-20]。試驗以溶液吸光度為指標(biāo)，選擇對提取率影響較大的3個因素料液比、提取時間、提取次數(shù)做正交試驗。以鎖陽多糖得率(mg/g)為評價指標(biāo)，通過正交試驗優(yōu)選鎖陽多糖的最佳提取條件。選取料液比、提取時間、提取次數(shù)作為考察因素，采用L9(33)正交表進(jìn)行試驗，見表1。

表1 鎖陽多糖提取工藝正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.3.4 供試樣品溶液的制備

按1.3.5節(jié)方法分別測定正交試驗樣品中多糖得率，確定最佳提取工藝，按照最佳提取工藝方法分別提取供試樣品。精密稱取鎖陽多糖供試樣品約20mg于50mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試樣品溶液。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[21-22]

取置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12h的D-葡萄糖49.36mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液(每1mL含D-葡萄糖0.4936mg)。精密量取上述對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL和7.0mL，分別置于25mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述溶液各2mL，分別加入5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，迅速加入7.0mL濃硫酸，搖勻后放置5min，水浴加熱30min，取出，冰水浴中冷卻至室溫，選擇中間質(zhì)量濃度的溶液于450～550nm的波長范圍進(jìn)行掃描，確定標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)硫酸苯酚法顯色后產(chǎn)物的最大特征吸收波長。并在該波長處測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)硫酸苯酚法顯色后產(chǎn)物的吸光度，每個質(zhì)量濃度梯度平行測定3次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 鎖陽中多糖得率計算

采用硫酸苯酚比色法，分別精密量取供試樣品溶液2mL，測定鎖陽供試樣品溶液經(jīng)硫酸苯酚法顯色后產(chǎn)物的吸光度，將結(jié)果代入回歸方程中，計算多糖得率。鎖陽中多糖得率為鎖陽粗粉中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即1g鎖陽中所含多糖的質(zhì)量/mg，計算公式：

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

按照文獻(xiàn)方法[18]于450～550nm的波長范圍進(jìn)行掃描，確定D-葡萄糖對照品經(jīng)硫酸苯酚法顯色后產(chǎn)物的最大特征吸收波長為486nm，結(jié)果見圖1。本實驗以此為標(biāo)準(zhǔn)吸光度來確定鎖陽多糖得率。

圖1 D-葡萄糖的吸收光譜曲線Fig.1 UV absorption spectrum of D-glucose

2.2 測定鎖陽多糖得率的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

圖2 D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of D-glucose

D-葡萄糖對照品經(jīng)硫酸苯酚法顯色后產(chǎn)物的最大特征吸收波長為486nm。以對照品質(zhì)量濃度/(μg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，D-葡萄糖的回歸方程為：Y=0.0553X＋0.0232，r=0.9985。結(jié)果表明，D-葡萄糖對照品質(zhì)量濃度在3.95～27.64μg/mL時，與吸收度具有良好的線性關(guān)系，結(jié)果見圖2。

2.3 單因素試驗

2.3.1 料液比對鎖陽多糖得率的影響

圖3 料液比對鎖陽多糖得率的影響Fig.3 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of polysaccharides

如圖3所示，采用不同料液比進(jìn)行提取，多糖提取得率有差別，料液比實際上是溶劑的用量大小，一般溶劑的用量越大提取得率也越大，但是過多的溶劑用量會造成溶劑和能源的浪費(fèi)，綜合考慮，選擇1:10～1:20(g/mL)料液比作為操作條件。

2.3.2 提取時間對鎖陽多糖得率的影響

圖4 提取時間對鎖陽多糖得率的影響Fig.4 Effect of time on extraction rate of polysaccharides

如圖4所示，鎖陽多糖得率隨時間的延長而升高，達(dá)到90min時得率最高，然后隨提取時間的延長略呈下降趨勢。時間的延長，有助于傳質(zhì)過程，使分子充分?jǐn)U散，有利于多糖物質(zhì)的溶出；但隨著提取時間的延長，也可能導(dǎo)致部分多糖物質(zhì)的分解或部分其他物質(zhì)的溶解而使鎖陽多糖得率下降。所以選擇30～90min作為提取操作條件。

2.3.3 提取次數(shù)對鎖陽多糖得率的影響

圖5 提取次數(shù)對鎖陽多糖得率的影響Fig.5 Effect of repeated extraction number on extraction rate of polysaccharides

如圖5所示，采用不同提取次數(shù)進(jìn)行提取時多糖提取得率有差別，一般提取得率隨提取次數(shù)增加而升高，為節(jié)約溶劑和能源，綜合考慮，選擇1～3次作為提取操作條件。

2.4 正交試驗及方差分析

表2 鎖陽多糖提取正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and corresponding experimental results

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis for extraction rate of polysaccharides with various extraction conditions

采用正交試驗優(yōu)化鎖陽多糖提取工藝的結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3[23]。由表2和表3極差分析結(jié)果表明，A、B、C三個因素對鎖陽多糖提取影響的主次關(guān)系為：提取次數(shù)＞料液比＞提取時間。提取次數(shù)、料液比和提取時間對鎖陽多糖的提取效率都有一定影響，提取的最佳工藝為A2B3C2，即料液比1:15、提取時間90min、提取次數(shù)為2次。用該條件進(jìn)行驗證實驗(樣品產(chǎn)地：甘肅張掖市)，多糖得率為43.39mg/g。

2.5 精密度實驗

精密量取對照品溶液2mL，共6份，按1.3.5節(jié)方法測定，結(jié)果吸收度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.27%，表明本方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗

精密量取同一供試品溶液2mL，共6份，按1.3.5節(jié)方法測定，吸收度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.34%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實驗

精密量取供試品溶液2mL，按1.3.5節(jié)方法操作，每10min測1次吸收度，到1h后改為20min測一次，吸收度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.59%，測定值在120min內(nèi)基本保持穩(wěn)定。以下吸光度測定均在120min內(nèi)完成。

2.8 加樣回收率實驗

精密稱取驗證實驗的鎖陽粉末(甘肅張掖市)6份，各約5g，編號1～6，每2份為1組。分別加入對照品溶液10.0、15.0、20.0mL，按照最佳提取工藝方法分別提取回收試驗樣品。分別精密稱取鎖陽多糖回收試驗樣品約20mg于50mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得回收試驗樣品溶液1～6。依法測定，計算回收率，結(jié)果均值為98.39%，RSD為0.94%，結(jié)果見表4。

表4 回收率實驗結(jié)果(n=6)Table 4 Recoveries of polysaccharides from spiked Cynomorium songaricum Rupr. roots (n=6)

2.9 樣品的含量測定

精密量取供試品溶液5mL于25mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液2mL，按1.3.5節(jié)方法測定，吸光度代入回歸方程計算多糖含量，結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測定結(jié)果(n=3)Table 5 Polysaccharide contents in root samples of Cynomorium songaricum Rupr. from different habitats in Hexi Corridor (n=3)

3 結(jié) 論

以水回流提取、乙醇沉淀法提取鎖陽多糖，用正交試驗優(yōu)化鎖陽多糖提取工藝，結(jié)果表明：以料液比為1:15，提取時間90min、提取次數(shù)2次時提取效果最好，優(yōu)化后的提取工藝穩(wěn)定可靠，可提高鎖陽多糖提取得率，為鎖陽多糖提取提供了一種新方法。

結(jié)果表明，河西走廊不同地區(qū)的鎖陽多糖含量差別很大，這可能與生長環(huán)境的土壤營養(yǎng)、水分、氣候等因素有關(guān)。研究結(jié)果為科學(xué)評價鎖陽藥材內(nèi)在質(zhì)量、優(yōu)質(zhì)藥材的選擇提供了科學(xué)依據(jù)。

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Optimum Extraction Process and Content Determination of Polysaccharides from Cynomorium songaricum Rupr.in Hexi Corridor Desert Area of Gansu

LUO Guang-hong1，WANG Qin2,*，ZU Ting-xun1，CHEN Tian-ren1
(1. The Provincial Key Laboratories of Characteristic Resource Utilization of Hexi Corridor in Gansu, Microalgae Engineering Research Center of Gansu Province, Kaiyuan Bio-tech Development Center, Hexi University, Zhangye 734000, China；
2. Zhangye Institute for Drug Control, Zhangye 734000, China)

The water extraction and ethanol precipitation of polysaccharides from the roots of Cynomorium songaricum Rupr.were optimized by orthogonal array design and the contents of polysaccharides in samples from different habitats in Hexi Corridor were determined by benzenol-H2SO4 method. Results indicated that the optimal extraction conditions were material/liquid ratio of 1:15 (g/mL), refluxing extraction duration of 90 min and repeated extraction number of 2. Root samples of Cynomorium songaricum Rupr. from different habitats in Hexi Corridor were significantly different from each other in their polysaccharide contents. Therefore, polysaccharide content can be used as a quality control indicator for Cynomorium songaricum Rupr..

Cynomorium songaricum Rupr.；polysaccharide；orthogonal test；extraction process；content determination

TS201.1；R284.1

A

1002-6630(2011)10-0079-05

2011-02-22

甘肅省科技支撐計劃項目(0804NKCG082)；甘肅省教育廳研究生導(dǎo)師計劃項目(0809-07)；甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室項目(XZ0707)

羅光宏(1965—)，男，教授，碩士，研究方向為植物資源開發(fā)與利用。E-mail：luoguanghong@163.com

*通信作者：王勤(1969—)，女，主任藥師，碩士，研究方向為藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及成分分析。E-mail：wangqin690529@yahoo.com.cn