液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定蜂蜜中4種四環(huán)素族抗生素及其3種差向異構(gòu)體

劉蓉蓉，吳黎明，周金慧，曾明華*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定蜂蜜中4種四環(huán)素族抗生素及其3種差向異構(gòu)體

劉蓉蓉1,2，吳黎明2，周金慧2，曾明華1,*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093)

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立同時(shí)測定蜂蜜樣品中4種四環(huán)素族抗生素及其3種差向異構(gòu)體的方法。蜂蜜樣品中殘留的藥物用EDTA-McIlvaine緩沖液提取，提取液依次經(jīng)OASIS HLB及羧酸弱陽離子柱固相萃取柱富集、凈化后，用流動(dòng)相洗脫。洗脫液經(jīng)微孔濾膜過濾，用流動(dòng)相甲酸水-乙腈梯度分離，電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測定。在多反應(yīng)監(jiān)測模式下，22min內(nèi)7種藥物基本實(shí)現(xiàn)分離以及定性定量。樣品在10～500μg/kg添加范圍內(nèi)，回收率均在64.9%～91.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于10.5%。土霉素及差向土霉素、四環(huán)素及差向四環(huán)素的檢測限為1μg/kg，金霉素及差向金霉素、強(qiáng)力霉素的檢測限為2μg/kg。本方法靈敏、可靠，可用于蜂蜜中7種四環(huán)素類抗生素的同時(shí)檢測(其中包括3種毒性代謝產(chǎn)物)。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；蜂蜜；四環(huán)素類抗生素；差向異構(gòu)體

四環(huán)素族抗生素藥物具有廣譜抗菌作用，幾十年來在藥品和食品添加劑中被廣泛應(yīng)用。在養(yǎng)蜂業(yè)，被用來防止蜜蜂感染幼蟲腐臭病[1-2]，使用較多的有四環(huán)素(tetracycline，TC)、土霉素(oxytetracycline，OTC)、金霉素(chlortetracycline，CTC)、強(qiáng)力霉素(doxycycline，DC)[1]。

從結(jié)構(gòu)式來看，四環(huán)素族分子中含有酚羥基、烯醇和二甲氨基，屬于酸堿兩性物質(zhì)，在強(qiáng)酸堿環(huán)境下不穩(wěn)定。在酸性(pH＜2)溶液中，C環(huán)C6位上的仲羥基與C5的氫發(fā)生反式消去形成雙鍵，C11-C11a-C12上雙鍵發(fā)生位移，使碳環(huán)發(fā)生芳構(gòu)化，生成脫水四環(huán)素(ATC)或脫水金霉素(ACTC)。在堿性溶液中，在OH－作用下C6位上的羥基形成氧負(fù)離子，進(jìn)攻分子內(nèi)的C11(羧基碳)，經(jīng)電子轉(zhuǎn)移導(dǎo)致碳環(huán)開裂，生成無活性的內(nèi)置異構(gòu)體，稱為異四環(huán)素類。在弱酸性(pH2～6)溶液中[2]，由于不對(duì)稱碳C4的構(gòu)型改變(圖1)，發(fā)生差向異構(gòu)化，反應(yīng)是可逆的，平衡時(shí)差向異構(gòu)體的比例可達(dá)40%～60%。蜂蜜具有穩(wěn)定的弱酸環(huán)境及17%～19%的水分含量，在加工貯存過程中，蜂蜜中殘留四環(huán)素族抗生素(tetracyclines，TCs)極易發(fā)生代謝，且主要產(chǎn)物為差向異構(gòu)體。四環(huán)素族抗生素差向異構(gòu)體(epitetracycline，ETCs)的藥效極低或消失，但毒副作用增加[3]，并且具有在特定環(huán)境下轉(zhuǎn)化回本藥的可能性[3-4]。

圖1 四環(huán)素差向異構(gòu)化反應(yīng)示圖Fig.1 Epimerization of tetracycline

對(duì)四環(huán)素族抗生素藥物的分離檢測一直是藥物分析中令人關(guān)注的研究課題。對(duì)于TCs及其立體異構(gòu)體的分離檢測也已有文章述及[5-8]，包括有對(duì)于牛奶中，液體豬飼料中。而且國內(nèi)外研究更多只是對(duì)母體四環(huán)素的論述。在保健食品行業(yè)，蜂蜜產(chǎn)品質(zhì)量倍受關(guān)注，對(duì)其中農(nóng)獸藥殘留物的檢測技術(shù)日漸成熟，但對(duì)降解產(chǎn)物的毒性研究及殘留測定則少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在前人工作的基礎(chǔ)上提出了基于高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)蜂蜜中4種常用TCs(TC、OTC、CTC和DC)及3種代謝物(差向四環(huán)素[epitetracycline，ETC]、差向土霉素[e p i o x y t e t r a c y c l i n e，E O T C]、差向金霉素[epichlortetracycline，ECTC])的同時(shí)測定，使得方法滿足蜂蜜中四環(huán)素類抗生素的殘留分析，同時(shí)可以對(duì)二級(jí)有毒代謝產(chǎn)物進(jìn)行痕量監(jiān)測，更準(zhǔn)確的考察出蜂蜜產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素的殘留情況，進(jìn)而為蜂場合理使用四環(huán)素族抗生素藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

TC、OTC、CTC、DC、ETC、EOTC、ECTC對(duì)照品 中國藥品生物制品檢定所。對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取適量TC、ETC、OTC、EOTC、CTC、ECTC和DC標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配制成 100mg/L(其中CTC、DC、ECTC為200mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于－22℃保存。根據(jù)需要用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在4℃保存，可使用3d。

0.2mol/L磷酸氫二鈉(優(yōu)級(jí)純)溶液、0.1mol/L檸檬酸溶液、Mcllvaine緩沖溶液pH5.0±0.05、0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖乙腈、乙酸乙酯、甲醇和甲酸銨(均為色譜純)；其余未注明為分析純；水為Millipore超純水。

6460A 三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀(配有Jet Stream噴霧電離源)、 ZORBAX SB-C18液相色譜柱(2.1mm×50mm，1.8μm) 美國安捷倫公司；Oasis HLB小柱(500mg，6mL)(使用前分別用 5mL甲醇和 10mL水預(yù)處理，保持柱體濕潤) 美國Waters公司；Supelclean LC-WCX SPE 小柱(500mg，3mL)(使用前用5mL乙酸乙酯預(yù)處理)、固相萃取裝置 美國Supelco公司；CR22G高速離心機(jī) 日本Hitachi公司；QB-210試管旋轉(zhuǎn)搖床 江蘇海門其林貝爾公司；N-EVAP 112氮吹儀 德國OA-SYS公司；JA2003電子天平(0.001g) 上海楚定科技公司；FE20pH計(jì) 瑞士Mettler-Toledo公司。

1.2 樣品前處理

1.2.1 提取

準(zhǔn)確稱取 6.0g待測蜂蜜樣品(精確至0.01g)于50mL離心管中，加入30mL 0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH5)，手搖萃取5min后，在12000r/min下離心5min，取上清液待凈化。如果遇到蜂蜜樣品結(jié)晶，在低于60℃水中加熱使其完全溶解，混勻后再稱樣。

1.2.2 凈化

將離心管中上清液倒入下接Oasis HLB固相萃取柱的貯液器中，使上清液以小于等于3mL/min的流速通過Oasis HLB固相萃取柱，用5mL甲醇-水(5:95，V/V)淋洗去除柱內(nèi)雜質(zhì)后，在65kPa負(fù)壓下減壓抽干30min。最后取15mL乙酸乙酯洗脫并將洗脫液通過預(yù)先活化的羧酸陽離子柱，用5mL甲醇淋洗后，減壓抽干5min。再用4mL流動(dòng)相洗脫收集洗脫液于樣品管中，并用流動(dòng)相定容至4mL，待測。

1.3 分析條件

色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB-C18(2.1mm×50mm，1.8μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈，梯度洗脫程序：見表1。流速：0.3mL/min；進(jìn)樣量：5μL；柱溫：3 0℃。

表1 梯度洗脫表Table 1 Gradient elution table

質(zhì)譜條件：霧化氣、脫溶劑氣、錐孔氣為氮?dú)?，碰撞氣為高純氮?dú)狻ｌF化氣壓力45psi；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流量10L/min；干燥氣溫度350℃；干燥氣流量6L/min；噴嘴電壓1000V；毛細(xì)管電壓4000V；電離方式：ESI＋；采集方式：MRM；駐留時(shí)間30ms；掃描范圍m/z 100～600。定性離子對(duì)、定量離子對(duì)和碰撞氣能量見表2。

表2 7種四環(huán)素類藥物的質(zhì)譜分析條件Table 2 ESI-MS/MS analysis conditions of tetracyclines

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

圖2 四環(huán)素族抗生素測定的主要前處理步驟Fig.2 Pre-treatment procedures for the determination of tetracyclines

2.1.1 提取條件的優(yōu)化

四環(huán)素抗生素在醇類中的溶解度較大[22]，在乙酸乙酯、丙酮、乙腈等有機(jī)溶劑中溶解度較小，在水中溶解度在mg/mL水平。由于TCs中活性基團(tuán)眾多，易與金屬離子形成配合物，又可以與生物樣本中的蛋白鍵合，所以樣品提取時(shí)需加入金屬絡(luò)合劑和強(qiáng)酸或酸性去蛋白試劑，但四環(huán)素溶液在pH＜2時(shí)可發(fā)生脫水反應(yīng)物，因此用含有金屬絡(luò)合劑的弱酸作為提取液，包括草酸及Mcllvaine。首先考慮到鹽類緩沖溶液在質(zhì)譜體系中造成毛細(xì)管接口聚集可損害質(zhì)譜壽命[23]，采用0.1mol/L Na2EDTA- McIlvaine緩沖液作為提取液，回收率最好。

為了考察提取液pH值對(duì)回收率的影響，分別配制pH2.5～6.0的Na2EDTA- McIlvaine緩沖液，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)添加蜂蜜進(jìn)行提取、凈化，計(jì)算回收率，比較提取效果。

表3 提取液pH值對(duì)回收率的影響(n=6)Table 3 Effect of pH on recovery rate(n=6)%

從表3可以看出，當(dāng)pH5.0時(shí)，其回收率較好。因此，本方法選擇pH 5.0的0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液做為提取液。在此弱酸環(huán)境下，緩沖液當(dāng)天提取時(shí)形成的差向四環(huán)素類可以忽略，并且在－20℃避光保存3d穩(wěn)定[24]，不影響測定方法重現(xiàn)性。

2.1.2 凈化條件的優(yōu)化

蜂蜜基質(zhì)成分復(fù)雜，尤其是相對(duì)肉制品，飼料等。由于共流物可能造成嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)，影響分析物的電離效應(yīng)，比如說糖類、鹽類、蛋白質(zhì)類、脂質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用了OASIS HLB固相萃取柱及離子交換萃取柱兩次固相萃取操作對(duì)樣品充分凈化，其標(biāo)準(zhǔn)溶液的柱回收率都很高，且重現(xiàn)性良好。

對(duì)于Oasis HLB固相萃取柱，對(duì)比乙腈、甲醇、甲醇-乙酸乙酯混合液、乙酸乙酯，等各種洗脫劑的效果。甲醇、乙腈洗脫能力較強(qiáng)，容易洗下過多雜質(zhì)，15mL乙酸乙酯可以滿足回收率及凈化條件。對(duì)于羧酸弱陽離子柱使用流動(dòng)相作洗脫劑，洗脫效果令人滿意，省去濃縮復(fù)溶環(huán)節(jié)，直接上機(jī)。因此，本方法選用流動(dòng)相作為羧酸離子柱的洗脫劑，洗脫劑用量對(duì)回收率的影響見表4。

表4 洗脫劑用量對(duì)回收率的影響(n=6)Table 4 Effect of eluent amount on recovery rate (n=6)%

從表4可以看出，使用羧酸離子柱，用4mL流動(dòng)相洗脫，可獲得理想的凈化富集效果。

2.2 儀器分析條件的優(yōu)化

文獻(xiàn)中報(bào)道的高效液相分離方法中，多采用反向分離柱，流動(dòng)相多為甲醇、乙腈及草酸溶液。使用ZORBAX SB-C18(2.1mm×50mm，1.8μm)，0.1%甲酸-乙腈流動(dòng)相梯度洗脫，除差土霉素和差向四環(huán)素不能完全分離外，其余可以達(dá)到較好的基線分離。

在質(zhì)譜分析中，首先在一級(jí)全掃描質(zhì)譜中得到TCs的準(zhǔn)分子離子峰，確定母離子[M＋H]＋，再選擇[M＋H]＋進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。通過優(yōu)化碰撞能，選擇子離子中相對(duì)豐度較大的特征離子作為優(yōu)化后定性離子對(duì)、定量離子對(duì)。準(zhǔn)分子離子可生成的主要碎片離子為[M＋H－NH3]＋和[M＋H－NH3－H2O]＋，丟失的NH3來自圖1中第4個(gè)環(huán)，丟失的H2O來自第2個(gè)環(huán)。色譜條件下未分離的差向土霉素和差向四環(huán)素通過監(jiān)測離子在MRM模式下仍然不影響分別定量。

2.3 定性定量分析

圖3 標(biāo)樣定性、定量離子的MRM圖(100μg/L)Fig.3 MRM chromatogram of standard sample at the concentration of 100μg/L and blank sample spiked with TC and ETC at the concentration of 100μg/L

圖4 空白添加樣(10μg/kg)的定性離子和定量離子MRM圖Fig.4 MRM Chromatogram of negative sample spiked with TCs and ETCs (10μg/kg)

按照1.3節(jié)所述方法分別對(duì)單標(biāo)溶液(添加水平分別為100μg/L)進(jìn)行全掃描，根據(jù)子離子相對(duì)豐度選擇定性定量離子。按照1.2節(jié)述及方法對(duì)空白蜂蜜樣品及添加TCs及ETCs后的空白蜂蜜中樣品進(jìn)行測定。其總離子流色譜圖及提取離子色譜圖見圖3、4，未添加TCs及ETCs的空白蜂蜜樣品的色譜圖略)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

用流動(dòng)相將各藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成TCs、ETCs濃度分別為4、40、200、400、600、800、1000μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.2節(jié)條件下，以藥物的質(zhì)量濃度/(μg/L)為橫坐標(biāo)(x)，以其峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表5。

表5 7種四環(huán)素類抗生素校正曲線的回歸分析Table 5 Regression analysis for calibration curves of 7 tetracyclines

2.5 檢測限與定量限

檢測限：添加1mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液60μL于6g空白蜂蜜樣品中(即添加水平為10μg/kg)，經(jīng)提取、凈化后測定，OTC、EOTC、TC、ETC的信噪比(RSN)大于30，CTC、ECTC和DC的RSN大于15，根據(jù)檢出限含量處的RSN等于3的原則，計(jì)算方法的檢測限分別為1μg/kg和2μg/kg。

定量限：添加1mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液150μL于6g空白蜂蜜樣品中(即添加水平為25μg/kg)，經(jīng)提取、凈化后測定，OTC、EOTC、TC、ETC的RSN大于90，CTC、ECTC和DC的RSN大于45，根據(jù)定量限含量處的RSN等于10的原則，方法的定量限分別為3.3μg/kg和6.7μg/kg。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

取空白蜂蜜樣品添加TCs、ETCs藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，制得10、50、500μg/kg(即1/2的最高殘留限量[maximum residue limits for veterinary drugs，MRLVDs]、MRLVDs和2倍的MRLVDs)3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)添加蜂蜜樣品，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)(每個(gè)水平下做6個(gè)平行實(shí)驗(yàn))，結(jié)果見表6。樣品在10～500μg/kg添加范圍內(nèi)，回收率均在64.9%～91.0%之間(差向異構(gòu)體水溶性較高，提取凈化環(huán)節(jié)的回收率較低)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于10.5%。

表6 TCS和ETCs回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 6 Recovery rates of oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline and doxycycline in honey (n=6)%

2.7 實(shí)際樣品的測定

應(yīng)用本方法測定了來自不同地區(qū)的34個(gè)蜂蜜樣品，其中一個(gè)蜂蜜樣品檢出有10-9級(jí)四環(huán)素及差向物殘留 (分別為5.4、4.9μg/kg)，一個(gè)有土霉素及差向物殘留(分別為10.6、3.8μg/kg)，表明商品蜜中殘留四環(huán)素確實(shí)在蜂蜜的加工儲(chǔ)存上架期內(nèi)發(fā)生差向異構(gòu)，殘留檢測和危害分析工作中應(yīng)該納入差向代謝物。

3 結(jié) 論

在樣品凈化時(shí)采用OASIS HLB固相萃取柱和羧酸型弱陽離子交換柱凈化，同時(shí)對(duì)其他分析參數(shù)做了進(jìn)一步優(yōu)化，改進(jìn)了凈化效果。從而提高了方法的靈敏度(檢測限達(dá)到1～2μg/kg)，增加了方法的穩(wěn)定性(RSD≤10.5)，提高了樣品回收率(64.9%～91.0%)。在對(duì)不同地區(qū)的不同樣品分析時(shí)，陽性樣品的分析值穩(wěn)定，空白樣品標(biāo)準(zhǔn)添加回收率實(shí)驗(yàn)及精密度實(shí)驗(yàn)顯示方法定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可以作為實(shí)際樣品中四環(huán)素及其差向物殘留測定項(xiàng)目的分析方法，并取得滿意效果。

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Simultaneous Determination of 4 Tetracyclines and 3 Epimers in Honey by HPLC Coupled with Tandem MS

LIU Rong-rong1,2，WU Li-ming2，ZHOU Jin-hui2，ZENG Ming-hua1,*
(1. School of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；
2. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China)

A method for simultaneous determination of 4 tetracyclines and 3 epimers in honey samples was developed by high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. The residues in honey samples were extracted by EDTA-Mcllvaine buffer, and cleaned up and condensed by OASIS hydrophilic-liphophilic balance (HLB) column and weak cation exchange (WCX and carboxylic acid) sequentially. Sample solution eluted from the WCX SPE column by mobile phase was filtered by micro-pours membrane, separated by LC-MS/MS with gradient elution using acetonitrile-formic acid solution as mobile phase and then qualitatively and quantitatively analyzed by ESI-MS/MS in a MRM mode. Baseline separation of 7 target drugs was achieved within 7 min, and qualitative and quantitative analysis was completed. The recovery rates of the spiked samples at trace levels were in the range of 64.9% to 91.0% with the relative standard deviation (RSD) less than 10.5%(n = 7). The detection limits were 1μg/kg for oxytetracycline, tetracyclines, 4-epitetracycline, 4-epioxytetracycline and 2 μg/kg for chlortetracycline, doxycycline and epichlortetracycline. The developed method was sensitive and reliable, and can be successfully applied to the simultaneous detection of 7 target tetracyclines residues including toxic metabolites in honey.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；honey；tetracyclines；epimers

TS252.1

A

1002-6630(2011)10-0232-05

2010-11-04

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(蜂)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(nycytx43-kxy9)

劉蓉蓉(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物源性食品安全。E-mail：liurongrong9301@yahoo.com.cn

*通信作者：曾明華(1956—)，男，副教授，碩士，研究方向?yàn)楂F醫(yī)藥理學(xué)和動(dòng)物毒理學(xué)。E-mail：zmhzmh@ahau.edu.cn