環(huán)糊精及其衍生物對(duì)普魯蘭酶抑制機(jī)理的研究

于 博，張煥新，金征宇，*，徐學(xué)明，謝正軍

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122; 2.江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品科技系，江蘇泰州225300)

環(huán)糊精及其衍生物對(duì)普魯蘭酶抑制機(jī)理的研究

于 博1，張煥新2，金征宇1，*，徐學(xué)明1，謝正軍1

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122; 2.江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品科技系，江蘇泰州225300)

通過研究不同條件下環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的差異，探討其對(duì)普魯蘭酶抑制的機(jī)理。結(jié)果表明，疏水性空腔對(duì)芳香族氨基酸的包合作用是環(huán)糊精與普魯蘭酶相互作用的內(nèi)在因素，空腔大小、側(cè)鏈基團(tuán)、濃度、pH與溫度都明顯地影響了環(huán)糊精與普魯蘭酶的相互作用。同時(shí)考察了不同環(huán)糊精濃度下的普魯蘭酶內(nèi)源性熒光光譜，分析了環(huán)糊精對(duì)普魯蘭酶結(jié)構(gòu)與微環(huán)境的影響。

環(huán)糊精，普魯蘭酶，疏水性空腔，芳香族氨基酸殘基，熒光光譜

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

α-環(huán)糊精(α-CD)、β-環(huán)糊精(β-CD)、γ-環(huán)糊精(γ-CD)、葡萄糖基-β-環(huán)糊精(G1-β-CD)和麥芽糖基-β-環(huán)糊精(G2-β-CD)sigma公司;普魯蘭酶 無錫杰能科生物有限公司;其他試劑 國(guó)產(chǎn)分析純。

V-1800分光光度計(jì) 上海美普達(dá)公司;AB135-S型電子分析天平、Delta320 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司;HH-2型恒溫水浴鍋 金壇市榮華儀器制造有限公司;F-7000熒光光譜儀 日本Hitachi公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 普魯蘭酶活性的測(cè)定 在0.5mL，1%的普魯蘭溶液中加入0.5mL適當(dāng)稀釋的普魯蘭酶溶液，反應(yīng)體系為pH的乙酸緩沖液，50℃反應(yīng)30min，采用DNS法測(cè)定還原糖的生產(chǎn)量，一個(gè)酶活力單位定義為每分鐘分解普魯蘭多糖生成相當(dāng)于1μmol葡萄糖的酶量。相對(duì)剩余酶活力(RRA)定義為添加環(huán)糊精及其衍生物時(shí)的酶活力與空白酶活力之比。普魯蘭酶使用前經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步純化。

1.2.2 熒光光譜測(cè)定 普魯蘭酶的熒光光譜用Hitachi F-7000熒光光譜儀測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)選擇295nm，發(fā)射波長(zhǎng)為200～400nm，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)狹縫寬度設(shè)定為5nm，掃描速度為12000nm/min，室溫下測(cè)定熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 環(huán)糊精種類對(duì)環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響

由圖1可知，在普魯蘭酶水解體系中加入各種環(huán)糊精后，普魯蘭酶的水解活性都受到了明顯的抑制。β-環(huán)糊精及其衍生物對(duì)普魯蘭酶的活性抑制明顯強(qiáng)于α-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精，由于環(huán)糊精與酶的相互作用與環(huán)糊精特有疏水性空腔有關(guān)，因此環(huán)糊精的空腔與普魯蘭酶分子是否匹配決定了其對(duì)酶活性的影響能力。三種常見的環(huán)糊精α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精的疏水性空腔直徑分別為0.47～0.53nm、0.6～0.65nm和0.75～0.83nm，其空腔外部圓周直徑以及空腔高度也各不相同，這些因素都影響到了環(huán)糊精分子與酶分子相互作用。由圖1可知，α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精加入后，普魯蘭酶的活性分別下降了約10%、90%和20%。這表明，β-環(huán)糊精分子具有更容易進(jìn)入酶分子空間的幾何尺寸，其疏水性空腔更加適合與酶分子的芳香族氨基酸發(fā)生包合作用。當(dāng)β-環(huán)糊精接枝上分支糖基后，其對(duì)普魯蘭酶的抑制能力發(fā)生了明顯的變化。由圖1可知，β-環(huán)糊精、葡萄糖基-β-環(huán)糊精和麥芽糖基-β-環(huán)糊精精加入后，普魯蘭酶的活性分別下降了約90%、70%和50%。隨著分支側(cè)鏈的延長(zhǎng)，環(huán)糊精抑制酶活性的能力遞減。這主要是因?yàn)榉种?cè)鏈通過α-1，6糖苷鍵接枝到母體β-環(huán)糊精后，增加了環(huán)糊精疏水性空腔與普魯蘭酶作用位點(diǎn)的空間位阻，而且分支鏈長(zhǎng)的增加不僅會(huì)增加空間位阻，更會(huì)影響到母體環(huán)糊精疏水性空腔固有的幾何尺寸與極性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，β-環(huán)糊精對(duì)普魯蘭酶的抑制作用最強(qiáng)。為進(jìn)一步了解環(huán)糊精與普魯蘭酶相互作用的影響因素，下面的實(shí)驗(yàn)主要考察不同條件下β-環(huán)糊精對(duì)普魯蘭酶活性的影響。

圖1 環(huán)糊精種類對(duì)環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響

2.2 環(huán)糊精濃度對(duì)環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響

在普魯蘭酶的水解體系中，分別添加不同濃度的β-環(huán)糊精，考察普魯蘭酶活性與β-環(huán)糊精濃度間的相關(guān)性。由圖2可知，隨著β-環(huán)糊精濃度的增加，普魯蘭酶的活性呈下降的趨勢(shì)。在環(huán)糊精濃度達(dá)到1mmol/L后，普魯蘭酶的失活速率增加;當(dāng)環(huán)糊精濃度達(dá)到10mmol/L時(shí)，普魯蘭酶的剩余酶活不足33%。這表明β-環(huán)糊精與普魯蘭酶的相互作用具有濃度依賴效應(yīng)，低濃度時(shí)，β-環(huán)糊精與普魯蘭酶分子的相互作用并沒有引起酶分子的活性構(gòu)象的變化;隨著β-環(huán)糊精濃度的增加，與普魯蘭酶分子相互作用的疏水性空腔增加，致使酶分子的活性構(gòu)象發(fā)生扭曲，酶活性逐漸喪失。

圖2 環(huán)糊精濃度對(duì)環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響

2.3 pH對(duì)環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響

由圖3可知，pH對(duì)環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響呈先增強(qiáng)后降低的趨勢(shì)，在pH4～6范圍內(nèi)，環(huán)糊精對(duì)普魯蘭酶抑制作用最強(qiáng)，當(dāng)pH為5時(shí)，普魯蘭酶的剩余酶活降至13%左右。pH的變化不僅會(huì)改變酶分子活性中心的必需基團(tuán)的解離程度，而且會(huì)影響酶分子的構(gòu)象變化。因此，pH4～6時(shí)的普魯蘭酶分子更適合與環(huán)糊精發(fā)生相互作用。這也說明，環(huán)糊精與普魯蘭酶的相互作用，不僅與環(huán)糊精自身的疏水性空腔有關(guān)，還與酶分子自身的性質(zhì)有關(guān)。

圖3 pH對(duì)環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響

2.4 溫度對(duì)環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響

由圖4可知，溫度對(duì)環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響呈先增強(qiáng)后降低的趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí)，普魯蘭酶的剩余酶活降至約11%。溫度的變化同樣影響了酶自身的構(gòu)象變化，因而影響了酶與環(huán)糊精疏水性空腔的相互作用。當(dāng)溫度升高時(shí)，酶分子間的聚集比低溫下變得松散，有利于環(huán)糊精分子進(jìn)入到酶分子中，從而與更多的疏水性氨基酸發(fā)生復(fù)合作用，導(dǎo)致酶活性構(gòu)象的喪失。

圖4 溫度對(duì)環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的影響

2.5 環(huán)糊精對(duì)普魯蘭酶微環(huán)境與結(jié)構(gòu)的影響

大部分的酶分子中都含有芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，而這三類氨基酸因側(cè)鏈生色基團(tuán)的不同而具有不同的熒光特性。其中色氨酸的熒光強(qiáng)度最大，酪氨酸次之，苯丙氨酸最小。在酶構(gòu)象的研究中，常常根據(jù)芳香族氨基酸的熒光特性來推測(cè)酶分子的構(gòu)象以及微環(huán)境變化。由于色氨酸殘基對(duì)微環(huán)境變化敏感，因此色氨酸殘基常作為酶分子的內(nèi)源性熒光探針來研究不同條件下酶分子構(gòu)象和微環(huán)境變化的信息。由圖5可知，在295nm激發(fā)波長(zhǎng)下，普魯蘭酶的最大發(fā)射波長(zhǎng)在340nm處。隨著β-環(huán)糊精濃度的不斷增加，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。這主要是由于隨著環(huán)糊精的加入，疏水性空腔逐漸增加，其與普魯蘭酶分子的芳香族氨基酸殘基之間的包合作用不斷增加，一方面保護(hù)了熒光體的單重態(tài)，避免了溶液中如氧自由基的猝滅，并束縛分子自由度，增大其輻射速率;另一方面，環(huán)糊精的疏水性空腔提供一個(gè)更加非極性的微環(huán)境，增強(qiáng)了熒光量子效率。這也進(jìn)一步證明了疏水性空腔與芳香族氨基酸殘基之間的包合作用是環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的內(nèi)在驅(qū)動(dòng)力。從圖5還可以看到，隨著環(huán)糊精濃度的增加，發(fā)射光譜發(fā)生了藍(lán)移，最大波長(zhǎng)由340nm藍(lán)移至337nm，這表明環(huán)糊精的加入改變了普魯蘭酶分子的結(jié)構(gòu)和微環(huán)境。酶分子致密的結(jié)構(gòu)逐漸變得松散，先前埋藏在酶分子內(nèi)部的一部分色氨酸殘基暴露在一個(gè)更加非極性的環(huán)糊精中，酶分子活性所處微環(huán)境的疏水性增加，活性構(gòu)象發(fā)生改變，從而導(dǎo)致普魯蘭酶的活性降低。

圖5 環(huán)糊精對(duì)普魯蘭酶內(nèi)源性熒光的影響

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過考察不同條件下環(huán)糊精對(duì)普魯蘭酶活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，疏水性空腔是環(huán)糊精及其衍生物與普魯蘭酶相互作用的內(nèi)在因素。疏水性空腔與普魯蘭酶的芳香族氨基酸殘基形成了復(fù)合物，改變了普魯蘭酶本身的活性構(gòu)象，導(dǎo)致了普魯蘭酶的失活。環(huán)糊精疏水性空腔的幾何尺寸是環(huán)糊精與普魯蘭酶相互作用的重要影響因素，其決定了二者相互匹配的效率。體系的pH與溫度影響了普魯蘭酶與環(huán)糊精的相互作用，其主要是由于酶自身結(jié)構(gòu)隨pH與溫度變化而變化，導(dǎo)致了環(huán)糊精與普魯蘭酶結(jié)合位點(diǎn)的改變。環(huán)糊精衍生物中，側(cè)鏈基團(tuán)的引入增加了空間位阻，降低了環(huán)糊精疏水性空腔與普魯蘭酶的結(jié)合率。

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Insight into inhibition mechanism of cyclodextrin and its derivatives on pullulanase

YU Bo1，ZHANG Huan-xin2，JIN Zheng-yu1，*，XU Xue-ming1，XIE Zheng-jun1
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.Food Science Department，Jiangsu Animal Husbandry and Veterinary College，Taizhou 225300，China)

Effects of different cyclodextrins on the activity of pullulanase were investigated to explore the inhibition mechanism of cyclodextrin on pullulanase in this work.The results indicated that the interaction between β-CD and pullulanase molecules was due to the formation of inclusion complexes between hydrophobic cavities and aromatic amino acid residues of pullulanase and was influenced by geometric dimension of hydrophobic cavities，side chain groups of cyclodextrin，concentration，pH and temperature.Meanwhile，the effect of cyclodextrin on the structure and microenvironment of pullulanase was analyzed by the intrinsic fluorescence spectroscopy.

cyclodextrin;pullulanase;hydrophobic cavities;aromatic amino acid residues; fluorescence spectroscopy

TS201.2+3

A

1002-0306(2011)03-0109-04

環(huán)糊精(Cyclodextrins，CDs)是由環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase)作用于淀粉而生成的一類環(huán)狀低聚糖，其具有一個(gè)環(huán)外親水、環(huán)內(nèi)疏水且有一定尺寸的立體手性空腔結(jié)構(gòu)，能與極性相似、分子大小匹配的不同類型客體分子形成主客體復(fù)合物［1］。在很多生物反應(yīng)中，環(huán)糊精可以與底物或催化反應(yīng)的酶分子基團(tuán)形成復(fù)合物，從而影響反應(yīng)速率或反應(yīng)平衡［2-3］。在一些生物反應(yīng)中，環(huán)糊精通過增溶反應(yīng)底物或激活酶加快反應(yīng)速率［4-5］;而在另一些反應(yīng)中，環(huán)糊精會(huì)成為酶反應(yīng)的抑制劑［6-8］。生物大分子復(fù)合物是近年來研究的熱點(diǎn)，隨著酶與有機(jī)小分子之間的相互作用的研究日益深入，環(huán)糊精作為酶反應(yīng)的激活劑或抑制劑，其作用機(jī)制亟需進(jìn)一步深入研究。普魯蘭酶(Pullulanase，E.C.3.2.1.41)是淀粉酶家族的一個(gè)重要成員，其在食品工業(yè)尤其是高葡萄糖漿、超高麥芽糖漿、啤酒發(fā)酵以及淀粉改性等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。它能專一性水解α-1，6糖苷鍵，并可以將最小單位的支鏈分解，最大限度地利用具有分支的淀粉原料［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)，在普魯蘭酶的水解體系中，β-環(huán)糊精的加入會(huì)使普魯蘭酶的活性大大降低［11］，而且動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)證明β-環(huán)糊精是普魯蘭酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑［12-13］。但是，環(huán)糊精抑制普魯蘭酶活性的機(jī)制仍不清楚，其相互作用的影響因素也需要進(jìn)一步的探索。因此，本實(shí)驗(yàn)主要通過研究不同條件下環(huán)糊精對(duì)普魯蘭酶活性的影響規(guī)律，探討環(huán)糊精對(duì)普魯蘭酶抑制的機(jī)理。

2010-11-17 *通訊聯(lián)系人

于博(1981-)，男，博士，研究方向:碳水化合物。

國(guó)際科技合作計(jì)劃(2007DFA31120);江蘇省自然科學(xué)基金創(chuàng)新學(xué)者攀登項(xiàng)目(BK2008003)。