張雁冰， 張全海， 張賽揚(yáng)， 馬 剛， 畢躍峰， 符 玲

(鄭州大學(xué) 藥學(xué)院 新藥研究開(kāi)發(fā)中心 河南 鄭州 450001)

皇冠果殼中皇冠苷A的提取工藝優(yōu)化及含量測(cè)定

張雁冰， 張全海， 張賽揚(yáng)， 馬 剛， 畢躍峰， 符 玲

(鄭州大學(xué) 藥學(xué)院 新藥研究開(kāi)發(fā)中心 河南 鄭州 450001)

用HPLC方法測(cè)定了皇冠果殼中皇冠苷A的含量，確定了HPLC法測(cè)定皇冠苷A含量的條件.測(cè)定結(jié)果為：皇冠果殼中皇冠苷A的含量不低于16.47 g/kg.用正交試驗(yàn)優(yōu)化了皇冠果殼中皇冠苷A的提取工藝，結(jié)果表明其理論最佳提取工藝條件為：用體積分?jǐn)?shù)55%的乙醇提取2次，每次提取1 h，每次所用乙醇的體積為皇冠果殼質(zhì)量的20倍.

HPLC； 皇冠苷A； 正交試驗(yàn)； 工藝優(yōu)化； 含量測(cè)定

0 引言

植物皇冠(Mahkotadewa)，屬瑞香科，主要分布于印度尼西亞.在當(dāng)?shù)?，皇冠的葉子、果實(shí)和樹皮廣泛用于治療肝炎、癌癥、心臟病、糖尿病和關(guān)節(jié)炎等多種疾病，具有顯著的療效，所以皇冠有“藥王”、“帝王仙樹”的美譽(yù)[1-6].對(duì)皇冠果殼的化學(xué)成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其含有大量的皇冠苷A，關(guān)于其含量測(cè)定及提取工藝的文獻(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道.作者建立反相高效液相法(HPLC)測(cè)定皇冠果殼中皇冠苷A的方法，并優(yōu)化了提取工藝，為進(jìn)一步研究植物皇冠提供科學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1材料

皇冠果殼(西北農(nóng)林科技大學(xué)林業(yè)系張文輝教授鑒定)，皇冠苷A對(duì)照品(本實(shí)驗(yàn)室提供)，乙腈(一級(jí)色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)，其他試劑均為分析純.

1.2主要儀器

UV-2550紫外分析儀(日本島津公司)；LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津公司)； Kromasil色譜柱(C18，5u，250 mm×4.6 mm)；奧利龍868臺(tái)式pH計(jì)；浩鵬ST-04A多功能粉碎機(jī).

圖1 皇冠苷A的紫外吸收?qǐng)D譜Fig.1 The UV absorption spectra of Mahkoside A

1.3皇冠苷A的HPLC含量測(cè)定方法

1.3.1皇冠苷A的紫外吸收 精密稱取0.001 0 mg皇冠苷A對(duì)照品于100 mL容量瓶，甲醇定容.以甲醇作為空白溶液，對(duì)其進(jìn)行200～400 nm波長(zhǎng)的紫外吸收掃描,結(jié)果如圖1所示，皇冠苷A的最大吸收波長(zhǎng)為293 nm，因此將HPLC的檢測(cè)波長(zhǎng)選定為293 nm.

1.3.2色譜條件 選用Kromasil色譜柱分離，流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L磷酸(三乙胺調(diào)pH為3.60)-水(體積比20∶1∶79)，檢測(cè)波長(zhǎng)為293 nm，柱溫為25 ℃，流速為 1 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，在此條件下，皇冠苷A的理論塔板數(shù)不低于3 500，對(duì)照品的HPLC如圖2所示，皇冠苷A在此色譜條件下，出峰時(shí)間為5.931 min，峰型良好.

圖2 皇冠苷A的HPLC圖Fig.2 The HPLC spectra of Mahkoside A

1.3.3對(duì)照品溶液的配制 精密稱取105 ℃干燥至恒重的皇冠苷A對(duì)照品0.039 0 g，置于25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置.然后分別精密量取1，2，3，4，5 mL于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，作為對(duì)照品溶液.

1.3.4線性關(guān)系 以皇冠苷A的峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：y=5×107x-75 911,r=0.999 4(n=5)，線性關(guān)系較好.

1.3.5供試品溶液的配制 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，每次提取時(shí)間確定為1 h，選取乙醇的體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)和單位質(zhì)量干燥藥材所用乙醇體積3個(gè)試驗(yàn)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)選.用多功能粉碎機(jī)將5.00 g皇冠果殼粉碎至纖維狀，按照正交試驗(yàn)方案進(jìn)行加熱回流提取，冷卻后過(guò)濾，將濾渣和濾液分離，然后用水將濾液稀釋至250 mL，搖勻，取600 μL于25 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻靜置，待用.

1.3.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于2，4，6，8，10，12 h進(jìn)樣，對(duì)皇冠苷A的峰面積進(jìn)行考察，RSD為0.196%(n=6)，說(shuō)明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好.

1.3.7精密度試驗(yàn) 對(duì)質(zhì)量濃度為0.274 56 g/mL的皇冠苷A對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，其峰面積的RSD為0.238%(n=5).

1.4皇冠苷A提取工藝的優(yōu)化及含量測(cè)定

吸取1.0 mL供試品溶液經(jīng)微孔濾頭過(guò)濾后于進(jìn)樣瓶中，在上述色譜條件下進(jìn)樣，隨機(jī)選取4組樣品,結(jié)果如圖3所示，皇冠苷A的峰型對(duì)稱，與其他峰分離良好，分離度在3.0以上，理論塔板數(shù)均在7 000以上.

圖3 部分樣品的HPLC圖Fig.3 HPLC analysis of some samples

每組樣品進(jìn)樣3次，取平均值，把皇冠苷A 的峰面積按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程進(jìn)行線性回歸，求得樣品溶液的濃度，進(jìn)而求出皇冠果殼中皇冠苷A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其結(jié)果見(jiàn)表1和表2.

表1 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

表2 極差分析表

2 結(jié)果

1)HPLC法測(cè)定皇冠苷A的實(shí)驗(yàn)條件為：Kromasil柱分離，流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L磷酸溶液(三乙胺調(diào)pH為3.60)-水(體積比20∶1∶79)，檢測(cè)波長(zhǎng)為293 nm，柱溫為25 ℃，流速為1 mL/min.

2)皇冠果殼中皇冠苷A的含量不低于16.47 g/kg.

3)由表1和表2可以看出，各因素的影響程度為B>C>A，因此，皇冠果殼中皇冠苷A的理論最佳提取工藝為B2C3A3，即用體積分?jǐn)?shù)55%的乙醇提取2次，每次提取1 h，每次所用乙醇的體積為皇冠果殼質(zhì)量的20倍.

3 討論

1)選定的流動(dòng)相對(duì)皇冠苷A與其他物質(zhì)有良好的分離效果.皇冠苷A在對(duì)照品溶液中的平均出峰時(shí)間約為5.93 min，而在藥材提取液中的平均出峰時(shí)間為6.03 min，可能是提取液中的其他物質(zhì)影響所致，屬于正常誤差.

2)根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果可知，關(guān)于溶劑體積這一因素，改變C2(16倍)為C3(20倍)能夠提取出更多的皇冠苷A，但增幅不大，故在實(shí)際操作中，考慮成本和效率，建議的提取工藝為B2C2A3，即用體積分?jǐn)?shù)55%的乙醇提取2次，每次所用乙醇的體積為皇冠果殼質(zhì)量的16倍.

結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC法測(cè)定皇冠苷A含量，方法準(zhǔn)確、快速、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好.

[1] Zhang Yanbing,Xu Xiangjun,Liu Hongmin．Chemical constituents fromMahkotadewa[J]．Journal of Asian Natural Products Research,2006,8(1/2):119-123.

[2] 張雁冰，徐向軍，井云環(huán)，等．皇冠果中揮發(fā)油成分分析[J]．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):理學(xué)版，2006，38(2)：84-86.

[3] 徐向軍，左玲霞，祁偉宏，等．皇冠果籽化學(xué)成分的分離提取[J]．化工時(shí)刊，2006，20(9)：45-47.

[4] Oshimi S,Zaima K,Matsuno Y,et al．Studies on the constituents from the fruits ofPhaleriamacrocarpa[J]．Journal of Natural Medicines，2008，62(2)：207-210.

[5] Ferrari J,Terreaux C,Sahpaz S,et al. Benzophenone glycosides fromGnidiainvolucratea[J]．Phytochemistry,2000,54(8):883-889.

[6] Hendra P,Fukushi Y,Hashidoko Y. Synthesis of benzophenone glucopyranosides fromPhaleriamacrocarpaand related benzophenone glucopyranosides[J]．Biosci Biotechnol Biochem,2009,73(10):2172-2182.

OptimizationoftheExtractionTechnologyandDeterminationofMahkosideAinNutShellofMahkotadewa

ZHANG Yan-bing, ZHANG Quan-hai, ZHANG Sai-yang, MA Gang, BI Yue-feng, FU Ling

(NewDrugResearchandDevelopmentCenter,SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

The content of Mahkoside A in nut shell ofMahkotadewawas determined by HPLC method.The results indicated that the content of Mahkoside A was not less than 16.47 g/kg. The extraction process for Mahkoside A in nut shell ofMahkotadewawas selected through orthogonal test,and the optimum extraction process was as follows: adding 20 times amount of 55% alcohol into medical materials,and refluxing and extracting for 2 times，each time for 1 h.

HPLC;Mahkoside A;orthogonal test;technology optimization;content determination

R 284.2;R 927.2

A

1671-6841(2011)04-0077-04

2011-04-01

張雁冰(1958-)，女， 教授， 博士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究，E-mail:zhangyb@zzu.edu.cn.