戴衛(wèi)健 李萌 朱發(fā)明 嚴(yán)力行

HLA基因具有高度的多態(tài)性，在不同地區(qū)、不同民族人群中，該基因及單倍型頻率分布存在顯著的差異。HLA多態(tài)性分析有助于提高器官移植供受者間配型成功率［1］。本研究采用PCR測(cè)序分型法分析浙江漢族人群HLA-A、B和C位點(diǎn)的等位基因及其單倍型，為非血緣關(guān)系器官移植配型、法醫(yī)鑒定、個(gè)體識(shí)別等研究積累資料。

1 材料與方法

1．1 材 料

浙江地區(qū)健康、無(wú)血緣關(guān)系的漢族無(wú)償獻(xiàn)血者100名，經(jīng)其知情同意后，采集外周靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。

1．2 方 法

采用血液基因組DNA抽提試劑盒(PEL-FREEZ公司，美國(guó))進(jìn)行基因組DNA抽提，嚴(yán)格按試劑說(shuō)明進(jìn)行操作。紫外分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣本DNA純度和濃度，－20℃保存。然后，擴(kuò)增HLA-A、B和C基因組全長(zhǎng)序列，擴(kuò)增引物由上海英俊生物有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL，其中含10×PCR緩沖液2．5μL，DNA模板約100 ng，LA TaqDNA 聚合酶1．0 U，dNTP、氯化鎂溶液終濃度分別為0．2 mmol/L和1．25 mmol/L，引物終濃度為0．3μmol/L。擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，67 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。之后，往每管PCR產(chǎn)物中加入核酸外切酶Ⅰ1μL(2 U)和堿性磷酸酶2μL(10 U)［寶生物工程(大連)有限公司］，在9700型PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀(ABI公司，美國(guó))上進(jìn)行酶切，37℃ 30 min，80℃ 15 min，以純化PCR產(chǎn)物。再以純化PCR產(chǎn)物為模板，按照BigDye測(cè)序試劑盒(ABI公司，美國(guó))操作說(shuō)明進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物序列見(jiàn)表2。測(cè)序反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min;95℃ 30 s，47℃45 s，60℃ 4 min，35個(gè)循環(huán);冷卻至4℃保存。測(cè)序結(jié)果采用Assign 3．5軟件進(jìn)行分析。

表1 HLAⅠ類(lèi)基因PCR擴(kuò)增引物序列

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，單倍型頻率計(jì)算、Hardy-Weinberg檢驗(yàn)均采用 ARLEQUIN 2．0軟件分析。

表2 HLAⅠ類(lèi)基因測(cè)序引物序列

2 結(jié)果

2．1 人群等位基因Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

本研究人群HLA-A、B和C經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，基因型期望值和觀察值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，表明樣本具有可信性。

2．2 HLAⅠ類(lèi)基因的等位基因分布

在浙江漢族人群中，共檢出22個(gè)HLA-A等位基因，頻率較高的等位基因?yàn)镠LA-A*11:0101(25．5%)、HLA-A*02:0101(13．5%)、HLA-A*24:0201(13．0%)，其中頻率大于1%的等位基因有13個(gè)，累計(jì)頻率為95%。共檢出42個(gè)HLA-B等位基因，頻率較高的等位基因?yàn)?HLA-B*40:0101(12．5%)、HLA-B*46:0101(10．0%)、HLA-B*58:01(8．5%)，其中頻率大于1%的等位基因有25個(gè)，累計(jì)頻率為89．5%。共檢出24個(gè)HLA-C等位基因，頻率較高的等位基因?yàn)镠LAC*07:0201(16．5%)、HLA-C*01:0201(15．0%)、HLA-C*03:0201(8．5%)，其中頻率大于1%的等位基因有17個(gè)，累計(jì)頻率為96%。

2．3 HLAⅠ類(lèi)基因單倍型頻率

共得到HLA-A-B單倍型125種，HLA-A-C單倍型104種，HLA-B-C單倍型122種，高頻的單倍型為 HLA-A*33:0301-B*58:01(7．5%)、HLA-A*11:0101-B*40:0101(5．0%)、HLA-A*11:0101-B*15:02(3．5%)、HLA-A*11:0101-C*07:0201(7．0%)、HLA-A*11:0101-C*08:0101(4%)、HLAA*02:07-C*01:0201(3．5%)、HLA-B*46:0101-C*07:0201(3．0%)、HLA-B*13:0201-C*06:0201(2．5%)、HLA-B*46:0101-C*01:0201(2．5%)。

3 討論

PCR測(cè)序分型方法是目前最準(zhǔn)確的分辨HLA基因型的方法，可以準(zhǔn)確顯示HLA基因高變區(qū)的全部核苷酸序列。HLAⅠ類(lèi)基因的多態(tài)性位點(diǎn)主要位于第2號(hào)和第3號(hào)外顯子，少數(shù)位于第1號(hào)和第4號(hào)外顯子［2］。本研究對(duì)HLAⅠ類(lèi)基因全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增，然后分別針對(duì)第2、3、4號(hào)外顯子設(shè)計(jì)測(cè)序引物，進(jìn)行雙向測(cè)序，對(duì)于有歧義的基因型對(duì)第1號(hào)外顯子進(jìn)行補(bǔ)測(cè)。

100名健康、無(wú)血緣關(guān)系的浙江漢族人群HLAA、B和C位點(diǎn)基因分型的研究結(jié)果表明，該人群HLAⅠ類(lèi)基因的基因多態(tài)性較為豐富，HLA-B位點(diǎn)檢測(cè)到的等位基因數(shù)最多，表現(xiàn)出最強(qiáng)的多態(tài)性，并且有其自身的獨(dú)特性。Mack等［3］研究結(jié)果顯示，在美國(guó)白種人群中的高頻率HLA-A、B和C位點(diǎn)等位基因?yàn)?HLA-A*02:0101(27．5%)、HLA-A*01:0101(14．2%)、HLA-A*03:0101(12．9%)、HLAB*07:02(10．4%)、HLA-B*08:01(9．0%)、HLAB*35:01(6．5%)、HLA-C*04:0101(12．9%)、HLA-C*07:02(11．5%)、HLA-C*07:01(16．1%)，波蘭人群HLAⅠ類(lèi)基因的頻率分布與美國(guó)白種人群相類(lèi)似［4］，而與本文資料所示浙江漢族人群不同。浙江漢族人群HLA-A各等位基因的頻率分布與韓國(guó)人群相似，但HLA-B*15:01較低，而HLA-B*40:0101、HLA-C*07:0201 的頻率則較高［5］。與我國(guó)其他地區(qū)比較，北方(黑龍江、北京、河北、河南)人群HLA-A*33:0301、HLA-A*11:0101、HLA-B*40:0101、HLA-B*58:01、HLA-C*03:0201、HLA-C*06:0201的頻率較低［6］，南方(廣東)漢族人群HLA-A*24:20、HLA-B*58:01 頻率較高，HLA-A*33:03、HLA-A*02:0101較低，而在廣東漢族人群中頻率較高的HLA-C*07:17在本研究中并未檢出［7］。

進(jìn)一步對(duì)浙江人群HLAⅠ類(lèi)基因的兩基因座單倍型及其頻率進(jìn)行分析，共得到351種兩基因座單倍型，高頻的有 HLA-A*11:0101-B*40:0101、HLA-A*33:0301-B*58:01、HLA-A*11:0101-C*07:0201、HLA-B*46:0101-C*07:0201。而美國(guó)白種人群中高頻兩基因座單倍型為HLA-A*01:0101-B*08:01、HLA-A*03:0101-B*07:02、HLA-B*07:02-C*07:0201、HLA-B*08:01-C*07:0101［3］，日本人群中的高頻兩基因座單倍型為HLA-B*40:02-C*03:04、HLA-B*07:02-C*07:0201、HLA-B*35:01-C*03:03［8］，均與我國(guó)浙江漢族人群不同。與基因頻率分布較相似的廣東漢族人群比較，浙江漢族人群兩基因座單倍型及其頻率也存在差異，廣東漢族人群的高頻兩基因座單倍型為HLA-B*40:0101-C*07:0201、HLA-B*58:011-C*07:0201［7］?？梢?jiàn)，不同地區(qū)和種族人群之間的單倍型頻率也有差異。

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