柑橘皮渣生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇的研究進(jìn)展*

陳海桂，顧楠，劉美艷，趙國華，2

1(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400715)

柑橘皮渣生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇的研究進(jìn)展*

陳海桂1，顧楠1，劉美艷1，趙國華1，2

1(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400715)

利 用柑橘皮渣生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇是一種生產(chǎn)乙醇的安全可再生的方法。以柑橘皮渣為原料，通過酶或酸進(jìn)行水解成可發(fā)酵糖液，利用糖酵解途徑發(fā)酵乙醇的微生物將其轉(zhuǎn)化為乙醇，提取脫水到99.5%濃度即得到燃料乙醇。這旨在解決柑橘產(chǎn)業(yè)大量副產(chǎn)物皮渣造成的環(huán)境污染資源浪費(fèi)，同時(shí)生產(chǎn)乙醇作為枯竭的石油能源替代品。柑橘皮渣轉(zhuǎn)化乙醇中，D-檸檬烯嚴(yán)重抑制微生物發(fā)酵，但合理控制各種影響因素可達(dá)到較高的乙醇產(chǎn)量。文中對柑橘皮渣生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇的過程及影響因素等進(jìn)行了綜述。

柑 橘皮渣，生物轉(zhuǎn)化，燃料乙醇

近幾年，乙醇作為替代石油的新能源前景堪好，生產(chǎn)方式有化學(xué)合成和生物轉(zhuǎn)化2種?；瘜W(xué)合成即乙烯水合法，因乙烯價(jià)格上漲使用減少。生物轉(zhuǎn)化是以農(nóng)產(chǎn)品、農(nóng)林廢棄物為原料，經(jīng)水解轉(zhuǎn)化成微生物可利用的糖發(fā)酵乙醇，因原料可再生、經(jīng)濟(jì)效益高而被廣泛采用。生物乙醇是使用最廣泛的生物燃料，多數(shù)歐洲國家的生物燃料乙醇占燃料替代品的15%，目前全球乙醇年產(chǎn)量達(dá)到了510億L［1］，乙醇作為新能源是未來發(fā)展趨勢。我國生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇使用的原料約80%來自于谷物，燃料乙醇生產(chǎn)量大幅度提高，原料供應(yīng)不足將彰顯突出，非糧原料如農(nóng)林廢棄物等才可為乙醇生產(chǎn)提供保障。

2008年我國柑橘產(chǎn)量達(dá)到2 331萬t。柑橘在鮮食或者加工中產(chǎn)生的柑橘皮渣占果實(shí)的40%～60%，高達(dá)1 000多萬t，發(fā)酵沼氣和制取乙醇最好的原料［2］。本文在論述生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇原理的基礎(chǔ)上，詳細(xì)介紹了生物轉(zhuǎn)化的過程及影響因素，以期為柑橘皮渣的利用和燃料乙醇的生產(chǎn)提供參考。

1 生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇的原理

微生物利用糖發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，其可在自身酶系統(tǒng)作用下，通過糖酵解途徑將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成乙醇和二氧化碳。如酵母菌在無氧條件下，將葡萄糖和果糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸后降解，通過脫羧作用生成乙醛，乙醛還原得到乙醇。

酵母菌乙醇發(fā)酵可分為前發(fā)酵期、主發(fā)酵期和后發(fā)酵期。在前發(fā)酵期，接種酵母后，酵母自身進(jìn)行生長繁殖;主發(fā)酵期，糖液中的可發(fā)酵糖快速分解，乙醇大量形成，發(fā)酵時(shí)間一般在24 h，發(fā)酵時(shí)間延長到48～72 h后，乙醇含量增加幅度小，乙醇產(chǎn)量已基本固定;后發(fā)酵期，酵母和固形物下沉，反應(yīng)逐漸停止。

圖1 柑橘皮渣生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇發(fā)酵過程

2 生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇的發(fā)酵過程

柑橘皮渣生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇的過程如下圖1所示。預(yù)處理后用酸或酶水解并進(jìn)行發(fā)酵作用，可以分步進(jìn)行或者同時(shí)糖化發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乙醇。一般采用同時(shí)糖化發(fā)酵作用，即水解與微生物發(fā)酵在同一容器內(nèi)同時(shí)進(jìn)行。

2.1 柑橘皮渣預(yù)處理

2.1.1 柑橘皮渣蒸汽爆破

柑橘皮渣中D-檸檬烯的含量為8～16 mL/kg，進(jìn)行蒸汽爆破主要作用在于去除D-檸檬烯，因其對釀酒酵母等微生物的發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用。檸檬烯蒸汽壓超過100℃，使用蒸汽爆破去除效果較好。處理時(shí)采取130～170℃，通過不斷加熱加壓達(dá)到預(yù)定溫度后釋放壓力，皮渣細(xì)胞壁在壓力驟減時(shí)破裂，外果皮中的D-檸檬烯被蒸汽帶出，皮渣中D-檸檬烯含量下降到0.1%以下，對微生物發(fā)酵抑制作用減弱。Widmer等［3］研究發(fā)現(xiàn)較高溫度和較長處理時(shí)間，去除D-檸檬烯含量較多。在160℃蒸汽爆破處理4 min，D-檸檬烯含量下降到0.08%。預(yù)處理后進(jìn)行酶水解48 h，水解液中糖含量從未預(yù)處理時(shí)的76%增長到94%。

同時(shí)，蒸汽爆破預(yù)處理能夠使水解酶進(jìn)入細(xì)胞纖維素壁，增大酸或酶與柑橘皮渣的接觸面積，使糖化作用更完全，因而對柑橘皮渣蒸汽預(yù)處理能顯著降低對酶水解的要求［4］。但有實(shí)驗(yàn)表明爆破可能會(huì)引起纖維素降解、部分纖維素解聚以及木質(zhì)纖維素改性［5］，導(dǎo)致糖液量下降。

2.1.2 柑橘皮渣水解處理

柑橘皮渣主要成分碳水化合物多聚糖，經(jīng)過酸或酶水解后成分是葡萄糖、半乳糖醛酸、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖等，其中葡萄糖、果糖、蔗糖等約占80%，以上糖均可被微生物利用發(fā)酵乙醇。

酸水解時(shí)，用蒸餾水稀釋蒸汽爆破后的柑橘皮渣，使固形物含量在15%左右。一定溫度下用稀H2SO4水解，控制在10 min以內(nèi)，水解后使用CaCO3調(diào)節(jié)pH。通過酸水解可精確測定纖維素和半纖維轉(zhuǎn)化為糖的量［6］。Grohmann 等［7］研究發(fā)現(xiàn)過濾柑橘皮渣酸水解液可去除部分D-檸檬烯順利進(jìn)行發(fā)酵。Pourbafrani等［8］實(shí)驗(yàn)得出最優(yōu)條件是在150℃下用稀H2SO4水解6 min，糖產(chǎn)量達(dá)到0.41 g/g柑橘皮渣干重。

柑橘皮渣酶水解時(shí)，常使用果膠酶、纖維素酶和半乳糖醛酸酶混合進(jìn)行處理。使用果膠酶處理柑橘皮渣能夠得到高濃度的糖液，而纖維素酶只對不可溶物有分解作用。果膠酶和纖維素酶結(jié)合使用是水解柑橘皮渣中碳水化合物多聚物的最有效方法［9］。糖化作用在柑橘皮渣含量高達(dá)22%～23%時(shí)仍能進(jìn)行，但得到的葡萄糖、果糖和蔗糖等可溶物含量降低，糖化作用速度下降2～3倍。非發(fā)酵糖和剩余的固體聚合物，干燥之后可以作為牛養(yǎng)飼料。Grohman等［10］研究發(fā)現(xiàn)熱H2SO4水解可溶性糖以及半纖維效果更好，同時(shí)酸水解明顯促進(jìn)之后使用纖維素酶和果膠酶水解柑橘皮渣的效率。

2.2 發(fā)酵乙醇的菌種篩選

發(fā)酵乙醇的菌種要具增值能力大、乙醇耐受性強(qiáng)并且產(chǎn)率高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。目前應(yīng)用較多的有釀酒酵母、馴養(yǎng)的古巴Ⅱ號(hào)菌、克魯維酵母、多變發(fā)酵單胞菌以及基因重組后能產(chǎn)乙醇的大腸桿菌KO11等，其中多變發(fā)酵單胞菌與大腸桿菌KO11對D-檸檬烯最低抑制濃度一致，為0.05%(v/v)，但多變發(fā)酵單胞菌乙醇產(chǎn)量明顯要高?？唆斁S酵母是耐高溫菌，Widmer等［11］對其在37～45℃進(jìn)行同時(shí)糖化發(fā)酵作用發(fā)現(xiàn)，克魯維酵母接種量大時(shí)性能較好，并且在42℃和45℃時(shí)也能產(chǎn)生乙醇，但乙醇量顯著下降到18%～38%。釀酒酵母在溫度高于37℃時(shí)性能不佳，但克魯維酵母能夠適應(yīng)高溫發(fā)酵乙醇。非酵母菌運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌比釀酒酵母和其他酵母乙醇產(chǎn)量更高，甚至產(chǎn)量可多達(dá)5倍［12］。

另外，Plessas等［13］使用一種商業(yè)釀酒酵母，使其固定在柑橘皮上用來發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時(shí)間約5～15 h，比常規(guī)方法24 h要短，同時(shí)乙醇產(chǎn)量能達(dá)到1 506 g/L。Bai等［14］提出若使用固定酵母，固定酵母的費(fèi)用，酵母細(xì)胞難以從固定體系中分離，以及增加了微生物污染的控制難度使固定酵母不能廣泛應(yīng)用。

表1 主要發(fā)酵菌生物轉(zhuǎn)化乙醇的情況

3 影響柑橘皮渣生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇的因素

3.1 D-檸檬烯

柑橘皮渣富含橘皮油，其主要成分為D-檸檬烯，對酵母的發(fā)酵具較強(qiáng)抑制作用，并且隨著發(fā)酵溫度和時(shí)間不同，最低抑制量也不同。David等［15］研究證實(shí)可通過加熱柑橘皮渣水解液除去D-檸檬烯，另一種方法是在酶水解后用離心法去除。Gerow［16］研究去除D-檸檬烯的最經(jīng)濟(jì)的方案以及最優(yōu)化溫度為蒸汽爆破溫度在110～132℃。但柑橘皮渣中D-檸檬烯在細(xì)胞內(nèi)以及皮渣的固形物中，所以去除的最適溫度應(yīng)該稍高些。

Wilkins等［17］研究了橘皮油對多變發(fā)酵單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響。在30℃發(fā)酵24、48、72、96 h后橘皮油濃縮液抑制的最低限量分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%;37℃ 發(fā)酵 24、48、72 h 后橘皮油濃縮液抑制的最低限量分別為0.05%、0.10%、0.20%，在96h后橘皮油對乙醇生產(chǎn)就不再有抑制作用。Wilkins等［18］研究發(fā)現(xiàn)D-檸檬烯濃縮液初始濃度≥0.33%(v/v)，或24 h發(fā)酵后濃度≥0.14%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇量減少。Wilkins等［19］研究了橘皮油對啤酒酵母和克魯維酵母在37℃發(fā)酵柑橘皮渣的抑制作用，啤酒酵母比克魯維酵母對橘皮油耐受性好。

3.2 發(fā)酵底物濃度

柑橘皮渣生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇過程中，糖液濃度對酵母菌的影響表現(xiàn)在對成熟醪液中乙醇產(chǎn)量以及酵母分解糖發(fā)酵的速度和利用率等方面。稀醪液可以提高酵母對糖分的利用率，更有利于生物轉(zhuǎn)化為乙醇。而濃醪液有利于減少乙醇提取濃縮時(shí)的蒸餾成本，但發(fā)酵底物濃度過高，抑制酵母發(fā)酵速度。另外，隨著發(fā)酵進(jìn)行底物中積累的乙醇對高耐乙醇的菌株的抑制作用較小。因此在菌種選擇上，選擇能夠耐高糖濃度和耐高乙醇濃度的發(fā)酵菌更有利于生產(chǎn)乙醇。Zhao等［20］研究補(bǔ)充鋅顯著提高了絮凝酵母對乙醇的耐受性以及耐熱性，從而提高乙醇產(chǎn)量。

3.3 發(fā)酵條件

生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇時(shí)，pH值、溫度、氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)等發(fā)酵條件對乙醇產(chǎn)量也有影響。一般在柑橘皮渣廢棄物初始pH值為4.8和pH值6.0時(shí)有較大的乙醇產(chǎn)量。保證培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)合適比例，既經(jīng)濟(jì)又可以一定幅度提高釀酒酵母的乙醇產(chǎn)量。River等［21］提出用擬牛頓法(QN)和實(shí)數(shù)編碼遺傳法(RGA)估算乙醇產(chǎn)量和溫度之間的相關(guān)性以及最佳發(fā)酵溫度。Perego等［22］研究發(fā)現(xiàn)不同溫度、稀釋率和糖濃度不同對乙醇產(chǎn)量影響顯著。在添加酵母提取液、蛋白胨、混合氨基酸、玉米浸漬液等營養(yǎng)物質(zhì)后菌種發(fā)酵乙醇的效率明顯提高。Karel等［23］利用大腸桿菌KO11發(fā)酵柑橘皮渣水解液生產(chǎn)乙醇時(shí)添加少量的氨基酸和肽，發(fā)酵動(dòng)力明顯增加。

4 燃料乙醇的提取和質(zhì)量指標(biāo)

乙醇的提取通常是先將醪液分餾得到乙醇粗餾分，再通過精餾得到水體積＜0.5%的無水乙醇產(chǎn)品即為燃料乙醇。從柑橘皮渣發(fā)酵產(chǎn)物中提取乙醇可以通過單級分批蒸餾法，連續(xù)蒸餾難度較大［24］。目前較成熟的脫水方法是恒沸蒸餾和萃取蒸餾，但由于存在能耗高的缺點(diǎn)，逐漸發(fā)展出滲透汽化、吸附蒸餾、共沸蒸餾、加鹽萃取蒸餾、變壓吸附以及超臨界萃取等方法。

生物轉(zhuǎn)化中為了得到高質(zhì)量的燃料乙醇，發(fā)酵醪液中要控制甲醇、甘油和雜醇油的產(chǎn)生外，要避免雜菌污染，蒸餾得到燃料乙醇時(shí)還需均衡進(jìn)汽和進(jìn)料以及控制溫度等。用紅外圖譜可鑒定乙醇的等級，醇的吸收峰C—O在1 049.265 cm－1為一級醇。

5 結(jié)論

燃料乙醇是一種可再生的替代逐漸石油資源的新能源。利用柑橘皮渣生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇，不僅能解決其污染環(huán)境、浪費(fèi)資源等問題，也為制備燃料乙醇提供了充足的原料。目前柑橘皮渣生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇的應(yīng)用還缺乏高新技術(shù)的支持，同時(shí)經(jīng)濟(jì)成本較高，如廠房、設(shè)備、運(yùn)輸和酶等的費(fèi)用仍是一大問題，當(dāng)前尤其需要誘變篩選得到高耐D-檸檬烯、耐高濃度糖液、乙醇量高產(chǎn)的菌株。乙醇脫水濃縮得到燃料乙醇過程中仍存在能耗高效率低或脫水技術(shù)難以工業(yè)化應(yīng)用的問題，是限制皮渣生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇產(chǎn)業(yè)規(guī)模發(fā)展的瓶頸，低成本高科技生物轉(zhuǎn)化燃料乙醇對于充分利用柑橘皮渣、緩解能源緊缺狀況至關(guān)重要。

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Progress on Fuel Ethanol Production from Citrus Peels by Biotransformation

Chen Hai-gui1，Gu Nan1，Liu Mei-yan1，Zhao Guo-hua1，2
1(College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China)2(Chongqing Key Laboratory of Agricultural Products Processing，Chongqing 400715，China)

Biotransformation of citrus peels for making fuel ethanol production is a safe renewable method.With citrus peels as materials by enzymes or acid hydrolysing into fermentable sugar，microorganisms by the glycolytic pathway ferment sugar into ethanol，and extract concentration of 99.5%dehydrated ethanol which are fuel ethanol.This is designed to address a large number of by-products of citrus industry that caused environmental pollution，while producing ethanol as the depletion of oil energy alternatives.D-limonene inhibits microbial fermentation when biotransformation of citrus peels，but the reasonable control of various factors will reach a high ethanol production.Citrus peels by biotransformation for making fuel ethanol and affecting factors were reviewed，which would provide valuable references for utilization of citrus peels and bio-ethanol production.

citrus peels，biotransformation，fuel ethanol

碩士研究生(趙國華教授為通訊作者，Email:zhaoguohua1971@163.com)。

*中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(XDJK2009B003)

2010－07－27，改回日期:2010－11－17