朱江敏，趙英梅，白 堅，李玉婷，張克銘，陳加偉，吳劍丙，王慧中

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036）

石斛共生真菌木霉菌拮抗作用的初步研究

朱江敏，趙英梅，白 堅，李玉婷，張克銘，陳加偉，吳劍丙，王慧中＊

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036）

為探討拮抗真菌及其次生代謝產(chǎn)物對石斛病原菌生長的影響，從藥用植物石斛中分離、鑒定和篩選出對常見病原真菌鐮刀菌（Fusarium）有拮抗作用的木霉菌（Trichoderma）.通過平板對峙培養(yǎng)，觀察其對鐮刀菌生長的影響；通過幾丁質(zhì)水解圈實驗，檢測木霉幾丁質(zhì)酶的活力.該研究所篩選獲得的木霉生防菌株，可應(yīng)用于石斛的栽培管理，提高石斛抗病能力.

石斛內(nèi)生菌；拮抗作用；生物防治

0 引 言

石斛是典型的菌根植物，在長期的接觸過程中，周圍環(huán)境中的真菌與石斛根共同生存進化[1].很多研究者已從多種石斛根中分離獲得各類有益、中性或有害的內(nèi)生真菌.其中有些內(nèi)生真菌不引起明顯病癥，有些真菌能促進石斛生長和發(fā)育，還有一些真菌不僅具有促生作用還能抑制有害真菌的生長，表現(xiàn)出強烈的拮抗效果[2].木霉菌（Trichodermaspp.）是一類開發(fā)比較成熟的生防菌，對許多常見的植物病原菌具有拮抗作用[3].研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌分泌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶是其抗菌作用的有效成分.不同的木霉菌株分泌產(chǎn)生不同的幾丁質(zhì)酶，有的只能夠水解病原真菌細(xì)胞壁的組成成分——幾丁質(zhì)，而并不使細(xì)胞質(zhì)外流；有的同時具有水解幾丁質(zhì)和拮抗病原真菌的活性，幾丁質(zhì)酶破壞細(xì)胞壁使細(xì)胞質(zhì)泄露，產(chǎn)生的細(xì)胞碎片誘導(dǎo)刺激宿主植物抗逆性.此外，拮抗真菌幾丁質(zhì)酶活性的增強伴隨著纖維素酶、β-1，3-葡聚糖酶及其他抗病蛋白的形成，有效抑制病原真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長[4－5].

石斛菌根中存在著包括木霉菌在內(nèi)的許多有益拮抗真菌，這些真菌在石斛抗病中發(fā)揮重要作用.對于真菌病害的防治，采用傳統(tǒng)的化學(xué)方法會帶來很多后續(xù)問題.生物防治技術(shù)是一種有效的綠色的防治方法，其原理是利用生物的競爭關(guān)系，調(diào)節(jié)有害生物種群密度.因此，利用微生物或其代謝產(chǎn)物（抗生物質(zhì)等）可對植物病原菌（包括土壤中的病原菌）進行有效防治[6].生物防治技術(shù)具有不污染環(huán)境、對人和其他生物安全、防治作用持久、產(chǎn)品無殘留，即易于同其他植物保護措施協(xié)調(diào)配合并能節(jié)約能源等優(yōu)點，必將在有害生物綜合防治中發(fā)揮越來越重要的作用.

該研究對課題組從野生石斛組織中分離的真菌進行拮抗性分析，從中獲得一株拮抗真菌，經(jīng)分子鑒定，該菌屬于木霉屬.同時，通過對峙平板培養(yǎng)驗證該菌能拮抗病原真菌鐮刀菌（Fusarium），并利用幾丁質(zhì)酶透明圈實驗分析檢測菌株胞外酶幾丁質(zhì)酶的活性.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試材料

真菌材料：實驗所用真菌為本實驗室從各地采集的野生石斛植物中分離獲得，并長期保存.

1.1.2 培養(yǎng)基及生化試劑

培養(yǎng)基：

①PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂4～5g.

② 膠體幾丁質(zhì)PDA：PDA培養(yǎng)基中加入2%膠體幾丁質(zhì)[7].

③ DNS試劑（g／L）：酒石酸鉀鈉91g，DNS 3.15g，NaOH 20g，苯酚2.5g，無水亞硫酸鈉2.5g.

④ 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基（g／L）：NH4NO33g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.6g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1g，膠體幾丁質(zhì)5g，pH5～6.

1.2 方法與步驟

1.2.1 F35菌株的鑒定

1.2.1.1 菌株DNA的提取與電泳檢測

從平板上刮取約100mg菌絲體移入1.5mL離心管中，加入600μL菌絲裂解緩沖液，用研缽充分研磨后，定容至1mL，于65℃水浴中保溫30min，期間充分混勻3次；加入等體積的苯酚／氯仿／異戊醇（V（苯酚）∶V（氯仿）∶V（異戊醇）＝24∶24∶1），輕搖混勻5min，12 000r／min離心10min；吸取上清液，加入等體積氯仿進一步抽提；離心后收集上清液，加入2μL RNase（10mg／mL），37℃水浴保溫30min；再次加入等體積氯仿抽提；吸取上清液，用2倍體積的100%乙醇沉淀析出DNA，并用70%乙醇洗滌沉淀2次，用適量TE溶解DNA，貯存于－20℃?zhèn)溆?

DNA電泳檢測.取3μL DNA樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳（100V，25min），以Trans 2KDNA Marker作為分子標(biāo)記，EB染色后，紫外燈下觀察拍照.

1.2.1.2 菌株rDNA ITS序列的獲得、純化及測序

石斛屬菌根內(nèi)生真菌rDNA ITS區(qū)段PCR擴增引物[8－9]：

PCR體系為（25μL）∶2.5μL 10×Buffer（含 Mg2＋）、2.0μL模板 DNA、1.5μL dNTP（2.5mM）、1.5μL P1（10μM）、1.5μL P2（10μM）、0.2μL Taq酶（2U／μL）、16.8μL滅菌ddH2O.混勻后，稍離心，放入PCR儀進行下列程序：96℃預(yù)變性2min；94℃變性45s；55℃退火45s；72℃延伸50s；進行35個反應(yīng)循環(huán)；72℃延伸5min.取5μL的PCR產(chǎn)物電泳檢測.

PCR擴增產(chǎn)物采用DNA片段快速純化／回收試劑盒回收（Axygen公司）.真菌ITS序列區(qū)段的克隆，按照pMD18-T Vector試劑盒（TAKARA公司）使用說明進行操作.選取陽性克隆由上海華大基因公司測序.

1.2.1.3 ITS序列Blast比對及比較分析

菌根內(nèi)生真菌rDNA ITS1和ITS2序列的起止范圍通過Blast比對，并參照GenBank中已有石斛菌根真菌的ITS范圍確定.用DNAStar軟件對所獲ITS序列進行系統(tǒng)分析，用最適全局排序選項對分離到的菌株F35進行同源性比對從而確定菌株種屬.

1.2.2 對峙平板拮抗實驗

將菌株F35和鐮刀菌株分別接種到PDA平板（直徑90mm）上，平板中心對稱兩點接種，兩菌株距離約4 cm.在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（25℃、60%濕度），3d后開始觀察菌落生長情況.以單獨接種病原真菌的平板作為對照，每處理重復(fù)3次.拮抗系數(shù)分為5級：Ⅰ級，木霉菌絲占據(jù)平板的100%；Ⅱ級，木霉菌絲占據(jù)平板＞2／3；Ⅲ級，木霉菌絲占據(jù)平板＜2／3，＞1／3；Ⅳ級，木霉菌絲占據(jù)平板＜1／3；Ⅴ級，病原菌占據(jù)平板100%[10].

1.2.3 木霉菌幾丁質(zhì)酶透明圈實驗

1.2.3.1 木霉發(fā)酵液的制備

將木霉菌株F35接種到PDA培養(yǎng)基平板（直徑9cm）上暗培養(yǎng)5d.同時配制木霉產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，每瓶100mL分裝于250mL三角瓶中，滅菌后備用.滅菌水浸泡木霉平板3～5min，用棉簽輕輕刮洗孢子及菌絲體，并4層紗布過濾除去菌絲體，濾液即為孢子懸浮液[7].用血球記數(shù)板對孢子進行計數(shù)，每瓶接種孢子按1.0×106個，置于恒溫?fù)u床培養(yǎng)5～6d（180r／min，25℃）.將發(fā)酵液經(jīng)4層紗布過濾，10 000r／min離心30min，取上清液備用.

1.2.3.2 膠體幾丁質(zhì)PDA平板透明圈實驗

制備膠體幾丁質(zhì)PDA，滅菌后倒板備用.在平板中央用直徑5mm的打孔器打孔，用滅菌槍頭分別吸取40μL滅菌的發(fā)酵上清液（用孔徑為0.22μm細(xì)菌濾器過濾滅菌）、標(biāo)準(zhǔn)幾丁質(zhì)酶液和無菌培養(yǎng)液加到孔中，用密封膠帶封口，于恒溫箱28℃保溫，5h后開始觀察透明圈的情況.每個處理重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株F35鑒定結(jié)果

F35純培養(yǎng)物，如圖1A平板所示，菌絲呈白色薄絨狀，生長迅速，后期產(chǎn)生黑綠色孢子團.提取菌株DNA，經(jīng)過電泳檢測（如圖1B）大小在20kb左右.引物P1和P2對F35總DNA進行擴增，獲得產(chǎn)物大小介于500～700bp之間（如圖1C）.

圖1 菌株F35鑒定結(jié)果Fig.1 The identity results of strains F35

將擴增獲得的ITS片段連接到pMD18-T載體上，PCR篩選陽性克隆，經(jīng)測序后分析獲得的PCR產(chǎn)物為606bp.將該序列在GenBank中進行同源比對，發(fā)現(xiàn)其與木霉屬（Trichoderma persoon）真菌（Gen-Bank中登錄號為DQ379015）同源性最高，達99.0%（見表1）.

2.2 平板對峙培養(yǎng)結(jié)果

將F35與病原真菌鐮刀菌進行平板對峙培養(yǎng)，結(jié)果表明，兩菌之間有明顯的抑菌區(qū)，木霉菌所產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)限制了鐮刀菌的進一步生長，使抑菌區(qū)周圍的鐮刀菌菌絲十分整齊（圖2B）.而對照組鐮刀菌的生長未受到任何的限制（圖2A）.同時，由于F35菌絲占據(jù)平板面積超過2／3，因此，判定F35對鐮刀菌的拮抗系數(shù)為Ⅱ級.

表1 基于真菌ITS序列的同源性比對Tab.1 Percentage nucleotide sequence identities between F35 and other fungi based on multiple alignments of ITS sequences

圖2 平板對峙培養(yǎng)Fig.2 Cultivate of plate confrontation

2.3 木霉菌幾丁質(zhì)酶透明圈實驗

利用膠體幾丁質(zhì)PDA平板測定F35分泌的幾丁質(zhì)酶活性.將含有F35幾丁質(zhì)酶粗提液的平板在28℃保溫條件下培養(yǎng)，5h后可隱約觀察到透明圈，7h后透明圈清晰可見.隨著保溫時間延長，透明圈不斷增大，經(jīng)過48h后透明圈直徑達2cm左右（見表2）.透明圈的出現(xiàn)進一步說明木霉菌株F35在誘導(dǎo)條件下發(fā)酵產(chǎn)生高活性的幾丁質(zhì)酶，能有效地催化分解細(xì)胞壁組成成分幾丁質(zhì).

表2 幾丁質(zhì)酶透明圈的大小變化Tab.2 The size of chitinase transparent circle

3 討 論

內(nèi)生真菌廣泛存在于植物組織內(nèi)部，有助于提高植物抗病抗逆能力，一方面可能是由于拮抗真菌激發(fā)了植物的某種抗逆機制，引發(fā)相應(yīng)的信號傳導(dǎo)過程，另一方面可能是由于真菌間的拮抗作用，導(dǎo)致病原菌生長受到抑制.目前，有關(guān)石斛內(nèi)生真菌的研究越來越受人們的重視，已發(fā)現(xiàn)野生石斛中存在大量內(nèi)生真菌，其中某些真菌在植株生長和發(fā)育過程中起重要作用[11－12].

該研究對實驗室分離保存的石斛內(nèi)生真菌進行分子鑒定，通過ITS序列測定及同源性比對，發(fā)現(xiàn)F35為木霉菌.由于根據(jù)ITS序列分析，只能鑒定到屬，因此，本實驗室將在后期通過分子、形態(tài)等手段對該菌進行進一步的鑒定.隨后該研究利用平板對峙培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)F35對常見病原真菌鐮刀菌有拮抗作用，其拮抗系數(shù)為II級.酶活性測定表明F35能分泌有活性的幾丁質(zhì)酶，分解真菌細(xì)胞壁的主要成分幾丁質(zhì)，這可能是F35能拮抗病原菌的真正原因.此外，木霉菌的次生代謝產(chǎn)物中還可能含有其他的拮抗物質(zhì)，需要對其代謝產(chǎn)物進行系統(tǒng)分析.同時，本實驗室將進一步測定F35及其它石斛內(nèi)生真菌對其他的病原菌的拮抗作用，為拮抗作用機理研究及生防菌的實際生產(chǎn)應(yīng)用提供實驗素材及理論依據(jù).

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Preliminary Studies on the Antagonism ofDenbrobiumMycorrhizal Fungi（TrichodermaPersoon）

ZHU Jiang-min，ZHAO Ying-mei，BAI Jian，LI Yu-ting，ZHANG Ke-ming，CHEN Jia-wei，WU Jian-bing，WANG Hui-zhong
（College of Life and Environment Science，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China）

To investigate the effect of antagonistic fungi and second metabolism products onDendrobiumpathogens，the experiment screened and identifiedTrichoderma，which was antagonistic toFusarium，from medicinal plantDendrobiumtissues.The effect of F35was determined by co-culture on PDA plates.The quantities of chitinase activity were detected through the chitin hydrolysis circle experiment.Trichodermaobtained in this study can be used inDendrobiumcultivation and management，which will improve the disease resistant ability ofDendrobium.

Dendrobiumendophytes；antagonism；biological control

Q939.5

A

1674-232X（2011）04-0340-05

2011-03-31

國家自然科學(xué)基金項目（30870180，31070298）；浙江省重大科技專門項目（2008C12081）；杭州市科技計劃項目（20080432T06，20101032B25）.

朱江敏（1985—），女，浙江杭州人，遺傳學(xué)專業(yè)碩士研究生，主要從事植物菌根互作研究.

＊通信作者：王慧中（1962—），男，浙江義烏人，教授，博士，主要從事植物系統(tǒng)生物學(xué)研究.E-mail：whz62＠163.com

10.3969／j.issn.1674-232X.2011.04.011