張蕓

（蚌埠市環(huán)境監(jiān)測(cè)站，安徽 蚌埠 233000）

藻是一種孢子植物，通過(guò)光合作用將二氧化碳轉(zhuǎn)變?yōu)樘妓衔铮账w中的氮、磷等物質(zhì)而生長(zhǎng)。這使得它們?cè)趦艋?(去除氮、磷)方面有著重要的應(yīng)用[1-3]。然而藻的過(guò)度生長(zhǎng)，導(dǎo)致水資源富營(yíng)養(yǎng)化，從而對(duì)水資源帶來(lái)負(fù)面影響。因此藻類與水環(huán)境的關(guān)系非常微妙。藻類分泌糖類等物質(zhì)的多少與藻的生長(zhǎng)狀況和水體的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量狀況相關(guān)，因此研究水藻分泌物質(zhì)(如糖)的含量與水體中總氮、總磷的關(guān)系，對(duì)研究水藻生長(zhǎng)引起的水體富營(yíng)養(yǎng)化狀況，生態(tài)保護(hù)性利用水資源有重要的意義。

水網(wǎng)藻是一種大型的網(wǎng)片狀或網(wǎng)袋狀水藻，其繁殖能力強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，在生長(zhǎng)過(guò)程中，能吸收大量的氮和磷等。本文以水網(wǎng)藻為研究對(duì)象，用不同氮、磷濃度比的營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)水網(wǎng)藻。通過(guò)監(jiān)測(cè)含藻水溶液中氮、磷含量與平衡總糖濃度，以考察含藻水體總氮、總磷與溶液中總糖濃度的相關(guān)聯(lián)系。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)器材與藥品

硝酸鉀：優(yōu)級(jí)純，中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司；磷酸二氫鉀：優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；氫氧化鈉、葡萄糖、苯酚、濃硫酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；過(guò)硫酸鉀：分析純，愛(ài)見(jiàn)德固賽（上海）引發(fā)劑有限公司；抗壞血酸：分析純，廣東汕頭市西隴化工廠；酒石酸銻氧鉀：分析純，上?；瘜W(xué)試劑總廠；鉬酸銨：分析純，上海膠體化工廠。

TU-1810PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、T6-新悅分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；高速離心機(jī)，上海儀器公司；水相針頭式濾器，孔徑0.45μm，直徑13mm，安譜科儀公司。

1.2 硫酸-苯酚法測(cè)總糖濃度[4]

由于水體中總糖濃度很低，天然產(chǎn)物的分離技術(shù)復(fù)雜，為簡(jiǎn)化問(wèn)題，本文用總糖濃度來(lái)表征糖的含量，將總糖酸解為單糖，折合成葡萄糖計(jì)算。

分別配置不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取所配葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml，加入0.5ml 6%的苯酚，再加入7ml硫酸顯色。20分鐘后，用分光光度計(jì)在485nm處測(cè)吸光度。以吸光度A與含葡萄糖量X/ug繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

取含藻水溶液，用3000r.min-1離心，取上部清液。用水相針頭式濾器過(guò)濾。取濾液5ml，同時(shí)加入5ml的1mol·dm-3鹽酸，在80℃的水浴中酸解3h，使溶液中的多糖全部酸解為單糖。冷卻液樣至室溫，用10%的NaOH溶液調(diào)節(jié)液樣pH值在7.5-8.5之間，再將之轉(zhuǎn)移到25ml的容量瓶中定容。取1ml液樣，依次加入0.5 ml 6%苯酚和7ml硫酸，20min后用10mm比色皿在485nm處測(cè)定吸光度。同時(shí)取去離子水作為空白樣。利用葡萄糖標(biāo)定方程式計(jì)算總糖含量，然后除以取樣體積，計(jì)算出總糖濃度。

1.3 過(guò)硫酸鉀紫外分光光度法測(cè)總氮濃度[5]

吸取不同體積的硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)使用溶液于25ml比色管中，用無(wú)氨水稀釋至10ml標(biāo)線，加入5ml堿性過(guò)硫酸鉀溶液，塞緊磨口塞，用紗布及紗線裹緊管塞，將比色管置于壓力蒸汽消毒器中，加熱0.5h，放氣使壓力指針回零，然后升溫至120～124℃開始計(jì)時(shí)，使比色管加熱0.5h后停止加熱，自然冷卻，取出比色管冷至室溫，加入（1+9）鹽酸 1ml，用無(wú)氨水稀釋至 25ml，在紫外分光光度計(jì)上，以零濃度溶液為參比，用10mm比色皿分別在220nm及275nm處測(cè)定吸光度，按A=A220-2A275繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

吸取適量離心后藻上清液按上述方法測(cè)量吸光度，并以去離子水為空白液，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算含總氮量，然后除以取樣體積，計(jì)算出總氮濃度。

1.4 過(guò)硫酸鉀消解-鉬銻抗分光光度法測(cè)總磷濃度[5]

吸取不同體積的磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用溶液于50ml比色管中，加入5%過(guò)硫酸鉀溶液4ml，加塞后管口包一小塊紗布并用線扎緊。置于高壓蒸汽消毒器中加熱，待鍋內(nèi)壓力達(dá)1.1kg/cm2時(shí)，調(diào)節(jié)電爐溫度使保持此壓力0.5h后，停止加熱，待壓力表指針降至零后，取出放冷。向比色管中分別加入1ml 10%抗壞血酸，混勻。30秒后加2ml鉬酸鹽溶液充分混勻，放置15min，用10mm比色皿于700nm波長(zhǎng)處，以零濃度溶液為參比，測(cè)量吸光度。以吸光度A和含總磷量X/ug繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取適量消解水樣加入50ml比色管中，用水稀釋至標(biāo)線，按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟顯色和測(cè)量，代人標(biāo)準(zhǔn)方程得出總磷含量，除以取樣體積，計(jì)算出總磷濃度。

1.5 藻種選取與培養(yǎng)條件

配 制 營(yíng) 養(yǎng) 液 ：（NaHCO3,16.8；NaNO3,2.5；K2SO4,1.0；MgSO4·7H2O,0.2；CaCl2·2H2O,0.04；K2HPO4·H2O,0.5；FeSO4·7H2O,0.01；Na-EDTA,0.08）100ml，稀釋至 1000 倍。按氮/磷質(zhì)量比分別為5:1、10:1和45:1加入硝酸鈉及磷酸氫二鉀。(其P含量為0.3，N含量分別為1.5、3.0和13.5mg·dm-3)。

精心挑選水網(wǎng)藻種，分離、純化后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。5d后將上述三種營(yíng)養(yǎng)液1000ml加入玻璃缸中，在自然光照下培養(yǎng)藻。分別簡(jiǎn)稱為樣品1、2和3號(hào)。實(shí)驗(yàn)跟蹤監(jiān)測(cè)溶液中的總糖，總氮，總磷濃度。

2 結(jié)果及討論

藻在生長(zhǎng)過(guò)程要吸收養(yǎng)分，同時(shí)還不斷的分泌出一些物質(zhì)。糖是藻細(xì)胞壁的主要成分之一，也是主要代謝產(chǎn)物。本文探討藻生長(zhǎng)與糖濃度的關(guān)系，水體營(yíng)養(yǎng)組分氮、磷的含量與糖濃度的關(guān)系。

2.1 藻胞外糖濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的變化

通過(guò)連續(xù)試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)在藻培養(yǎng)過(guò)程中，水體的總糖濃度并不是連續(xù)積累的，而是隨藻生長(zhǎng)狀況發(fā)生變化。初始階段(0-17d)，由于營(yíng)養(yǎng)液組成的差異，藻生長(zhǎng)環(huán)境不同，總糖濃度也存在差異。就總的趨勢(shì)來(lái)看，3個(gè)樣品的糖濃度都在減少。此時(shí)，藻在生物量增長(zhǎng)期，糖濃度的減少是由于糖被消耗或利用，含藻水溶液中總糖濃度與藻生物量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。在t=17d，三個(gè)樣品的糖濃度均達(dá)到各自的一個(gè)最低點(diǎn)。

在17～25d階段，糖濃度隨培養(yǎng)時(shí)間顯著增加，在25d左右達(dá)到一個(gè)小的高峰。這是因?yàn)樵谔菨舛群艿蜁r(shí),藻生長(zhǎng)受到抑制，隨后出現(xiàn)藻含量降低。由于在藻生長(zhǎng)期，水中糖含量減少；若藻生長(zhǎng)停止，釋放出更多的糖。藻含量降低，從而導(dǎo)致糖濃度開始升高。在觀察后期（大于30d），糖濃度除個(gè)別點(diǎn)外，在相對(duì)穩(wěn)定的濃度區(qū)間波動(dòng)，表示藻生長(zhǎng)維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的階段。

2.2 總氮濃度對(duì)總糖濃度的影響

通過(guò)試實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)在多數(shù)情況下，溶液中總糖濃度與總氮濃度呈一種反向變化關(guān)系。即當(dāng)總氮處于低點(diǎn)時(shí)，總糖則處于高點(diǎn)；而當(dāng)總氮處于高峰時(shí)，總糖則處于低谷。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：氮鹽不僅影響藻的生長(zhǎng)，而且還影響溶液中總糖濃度。氮是藻生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)元素，參與生物的新陳代謝，決定了藻生物量的累積，是初級(jí)生產(chǎn)力的限制因子。當(dāng)總氮濃度較高時(shí)，糖的濃度沒(méi)有積累，這可能和糖被吸收有關(guān)?？偟龃髸r(shí)，它不僅有利于藻的生長(zhǎng)，同時(shí)也加速細(xì)菌和異養(yǎng)生物的生長(zhǎng)，此時(shí)藻分泌糖的速度并不高，而藻和異養(yǎng)生物的糖消耗量卻在增大。另一方面，氮鹽還是多糖合成的限制因素[6,7]。藻對(duì)氮素缺乏的反應(yīng)是合成含氮分子和蛋白質(zhì)的速度降低甚至停止，但光合作用合成碳水化合物的反應(yīng)仍在進(jìn)行，相關(guān)文獻(xiàn)也表明，氮限制條件下，藻的主要活性反應(yīng)是合成胞外多糖。

2.3 總磷濃度與總糖濃度的關(guān)系

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)元素之一，許多藻類都可以利用不同形式的磷作為生長(zhǎng)發(fā)育的磷的來(lái)源。因此，磷源也是藻類生長(zhǎng)的影響因子[3,6]。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)水網(wǎng)藻體系在人工培養(yǎng)液條件下，水體中總磷與總糖濃度也呈反向變化關(guān)系。總磷與總糖的關(guān)系類似于總氮與總糖的關(guān)系，對(duì)這一關(guān)系的解釋也有相似的機(jī)理。

3 結(jié)論

水體富營(yíng)養(yǎng)化與水藻代謝糖和環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)狀況有關(guān)。在水網(wǎng)藻的培養(yǎng)過(guò)程中，總糖濃度并不是連續(xù)積累的，而是與藻的生長(zhǎng)狀況有關(guān)，同時(shí)受水體中氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度的影響。水體中總氮 總糖、總磷 總糖均呈現(xiàn)反向變化關(guān)系。氮、磷濃度增高，有利于促進(jìn)藻生長(zhǎng)，它同時(shí)也促進(jìn)細(xì)菌和異養(yǎng)生物等對(duì)糖的吸收，總的結(jié)果是導(dǎo)致總糖的濃度降低；當(dāng)溶液中氮、磷濃度降低時(shí)，藻合成蛋白等含氮、磷分子的反應(yīng)停止，但合成碳水化合物以及糖的反應(yīng)仍繼續(xù)，從而導(dǎo)致糖濃度的增加。

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