摘 要:通過(guò)對(duì)維生素C一步發(fā)酵菌種生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，可簡(jiǎn)化一步菌種生產(chǎn)工藝流程和有效地防止菌種衰退，降低生產(chǎn)成本。

關(guān)鍵詞:維生素C 黑醋菌 一步發(fā)酵 培養(yǎng)基 種液 茄瓶

中圖分類號(hào):Q57\t\t\t文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A\t\t\t文章編號(hào):1672-3791(2011)10(a)-0104-01

維生素C大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)采用“二步發(fā)酵法”[1]，第一步是用生黑葡糖桿菌將D-山梨醇發(fā)酵轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-山梨糖，簡(jiǎn)稱“一步發(fā)酵”;第二步是由氧化葡萄糖酸桿菌和巨大芽孢桿菌經(jīng)適宜協(xié)調(diào)混合培養(yǎng)，將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為維生素C的前體2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)，簡(jiǎn)稱“二步發(fā)酵”。本文結(jié)合生產(chǎn)試驗(yàn)對(duì)一步發(fā)酵菌種生產(chǎn)工藝做進(jìn)一步探討。

1 材料與方法

1.1 菌種

生黑葡糖桿菌(GLuconobacten melanogenus俗稱黑醋菌)為江蘇江山制藥有限公司菌種室保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基

種液培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基，發(fā)酵瓶培養(yǎng)基均采用工業(yè)生產(chǎn)上的配方，120℃，0.1MPa，滅菌30min。

1.3 一步發(fā)酵黑醋菌生產(chǎn)工藝流程

傳統(tǒng)工藝:冷凍管→種液平皿上劃曲線→搭茄瓶→種液→進(jìn)入種子罐。

(1)種液制備:從培養(yǎng)好的黑醋菌茄瓶斜面上刮1～2環(huán)，接入裝有種液培養(yǎng)基的搖瓶中，180r/min，30℃振蕩培養(yǎng)18h～24h，用斐林法測(cè)定山梨糖含量在100mg/ml以上，pH5.1，鏡檢不染菌。

(2)茄瓶制備:用上述種液在固體培養(yǎng)基(種液平皿)上劃曲線，30℃恒溫箱培養(yǎng)48h，在培養(yǎng)好的種液平皿上用接種針挑起聚集在一起黑醋菌菌團(tuán)幾環(huán)，接入茄瓶的空白斜面上，涂勻，30℃恒溫箱培養(yǎng)48h。

(3)發(fā)酵瓶培養(yǎng):按8%的接種量將種液接入發(fā)酵瓶培養(yǎng)基中，180r/min，30℃振蕩培養(yǎng)16h、18h、24h分別從發(fā)酵瓶中取樣，用斐林法測(cè)定山梨糖含量。

1.4 分析方法

(1)一步發(fā)酵L-山梨糖的測(cè)定:斐林法測(cè)定含糖量。(2)光學(xué)顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化工藝流程(一)

冷凍管→搭茄瓶→種液→進(jìn)入種子罐。

(1)試驗(yàn):用上述培養(yǎng)好的一步種液直接滴入茄瓶空白斜面上涂勻，再制備種液（如表1)。

結(jié)果:用上述培養(yǎng)好的一步種液吸0.2ml直接滴入茄瓶空白斜面上較適宜。

2.2 優(yōu)化工藝流程(二)

冷凍管→分離平皿→搭茄瓶→種液→進(jìn)入種子罐。

(1)茄瓶制備:取上述種液經(jīng)過(guò)無(wú)菌水稀釋至10-7～10-8，吸0.1ml稀釋菌液滴入空白分離培養(yǎng)基平皿上，涂勻，30℃恒溫箱培養(yǎng)72h。從培養(yǎng)好的分離平皿上挑選形態(tài)好的單個(gè)菌落幾環(huán)接入空白茄瓶斜面上，涂勻，30℃恒溫箱培養(yǎng)48h。

2.3 防止一步黑醋菌退化的措施

黑醋菌從斜面定期移植，頻繁的傳代會(huì)加速菌種退化。為了防止黑醋菌退化，傳統(tǒng)工藝、優(yōu)化工藝(一)必須定期取上述種液經(jīng)過(guò)無(wú)菌水稀釋至10-8～10-9，吸0.1ml稀釋菌液，滴入空白D-葡萄糖-CaCO3培養(yǎng)基平皿上涂勻，30℃恒溫箱培養(yǎng)7d～10d。根據(jù)溶鈣圈的大小來(lái)篩選圓形、直徑在0.8cm～1.5cm的溶鈣圈上的黑醋菌傳代為佳。優(yōu)化工藝(二)每做一批種液就從分離平皿上篩選形態(tài)好的單個(gè)黑醋菌傳代，來(lái)減少菌種退化。

2.4 上述三種一步菌種生產(chǎn)工藝之間的比較(如表2)

結(jié)果:(1)優(yōu)化工藝(一)是在傳統(tǒng)工藝上去除“在種液平皿上劃曲線”這一步驟。(2)優(yōu)化工藝(二)有分離平皿操作，能有效防止菌種退化。

3 結(jié)語(yǔ)

生產(chǎn)試驗(yàn)表明在不影響菌種生產(chǎn)的前提下，優(yōu)化工藝(一)能簡(jiǎn)化菌種工藝流程，又節(jié)約了生產(chǎn)成本。優(yōu)化工藝(二)能有效防止菌種退化。國(guó)外報(bào)道維生素C“二步發(fā)酵法”的新工藝是利用基因工程菌將D-山梨醇直接發(fā)酵產(chǎn)生2-KLG，它能大大簡(jiǎn)化工藝，降低成本。

參考文獻(xiàn)

[1]\t尹光琳，陶增鑫，嚴(yán)自正，等.維生素C前體2-酮基-L-古龍酸的優(yōu)良菌株的篩選[J].微生物學(xué)報(bào).1980，20(3):246～251.

①作者簡(jiǎn)介:何鑒清(1964—)，女，江蘇靖江人，中級(jí)職稱。