吳娟子，王強(qiáng)，鐘小仙，陳建群

（1.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京210093；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所，江蘇 南京210014）

互花米草（Spartinaalterniflora）是一種原產(chǎn)北美大西洋沿岸的禾本科米草屬的多年生六倍體植物［1］，因其促淤造陸和消浪護(hù)堤作用顯著而被許多國家引種［2，3］。1979年南京大學(xué)從美國東南部的北卡羅萊納州、喬治亞和佛羅里達(dá)州引種的3種不同生態(tài)型互花米草種子及植株，首先被移栽至福建羅源，種子成熟后再經(jīng)沿海各省灘涂多點(diǎn)引種，互花米草的種植取得了一定的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益［4－6］。但作為外來入侵物種，其強(qiáng)大的繁殖能力和高大密集的種群特征，對我國沿海灘涂地區(qū)的生物多樣性和水產(chǎn)養(yǎng)殖具有一系列不良影響，對生態(tài)系統(tǒng)造成了極大危害，2003年初，互花米草被環(huán)?？偩至袨槲覈谝慌?6種外來入侵物種名單［7］，互花米草的生物入侵問題越來越受到有關(guān)部門和研究者的關(guān)注，我國已有的研究主要關(guān)注互花米草的生物學(xué)特性、競爭性排斥、生態(tài)位替代、危害及控制技術(shù)等，對其入侵?jǐn)U張的分子機(jī)制研究較少［7－9］，有關(guān)互花米草在我國地理種群內(nèi)的遺傳變異及其演化路徑、入侵過程中的快速適應(yīng)與進(jìn)化機(jī)制等入侵?jǐn)U張的分子機(jī)理有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

大量的研究表明，外來入侵種能在如此短的時間內(nèi)迅速地作出適應(yīng)性的進(jìn)化，可能與其自身的遺傳結(jié)構(gòu)密切相關(guān)［10－12］。因此，對入侵物種種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究將有助于理解其入侵進(jìn)化機(jī)制。DNA分子作為遺傳信息的直接載體不受外界因素和生物體發(fā)育階段及器官組織差異的影響，因此DNA分子標(biāo)記技術(shù)和直接的DNA測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于揭示DNA序列差異，分析種群的遺傳結(jié)構(gòu)。應(yīng)用較多的分子標(biāo)記技術(shù)主要有RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNAs，randomly amplified polymorphic DNAs）［13］、ISSR（簡單重復(fù)序列間多態(tài)性，inter simple sequence repeat）［14］、SRAP（相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性，sequence related amplified polymorphism）［15］和 AFLP標(biāo)記（擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，amplified fragment length polymorphism）［9］等。同分子標(biāo)記技術(shù)等指紋技術(shù)相比，DNA 測序能夠提供最直接、最可靠的數(shù)據(jù)，且更易數(shù)字化，便于數(shù)據(jù)的分析、交流和檢索。因此本研究將采用DNA直接測序的方法，研究我國互花米草種群的遺傳結(jié)構(gòu)。

一般來說，葉綠體基因組屬于單親遺傳，并且結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定，極少或者不發(fā)生重組和種內(nèi)變異，但是葉綠體的一些基因間區(qū)序列進(jìn)化速度較快，常用于植物的系統(tǒng)發(fā)育研究和遺傳進(jìn)化分析。trnT－trnF序列為植物葉綠體基因組的一段序列，由編碼tRNA的trnT（UGU）3′外顯子至trnL（UAA）基因的基因間區(qū)，trnL（UAA）內(nèi)含子以及trnL（UAA）3′外顯子至trnF（GAA）之間的基因間區(qū)組成，2段非編碼區(qū)序列進(jìn)化速率快，能提供較多的信息位點(diǎn)，多用于較低分類階元及近期分化類群間系統(tǒng)發(fā)育和種間品種的鑒別研究［16］。也有研究表明該序列可用于某些類群種間甚至種下居群水平的研究［17］。早在1991年，Taberlet等［16］在這一位點(diǎn)上就設(shè)計(jì)了通用引物用于擴(kuò)增這一序列，該序列在許多植物中均較易擴(kuò)增，且序列質(zhì)量較高。

本研究通過分析南起福建羅源，北至天津塘沽的8個互花米草種群的cpDNAtrnT－trnF的2段非編碼區(qū)序列（trnT－trnL和trnL－trnF）的測序數(shù)據(jù)，初步研究了我國互花米草種群的遺傳結(jié)構(gòu)，旨在了解我國互花米草種群的遺傳多樣性結(jié)構(gòu)，比較我國互花米草同原產(chǎn)地互花米草的遺傳多樣性差異，分析互花米草葉綠體基因的譜系來源，探討互花米草種群遺傳結(jié)構(gòu)形成的相關(guān)因素。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2009年4－10月，沿緯度梯度選取我國東部沿海鹽沼的8個互花米草種群（表1），每一種群隨機(jī)選取約30株健康植株，植株間距大于50m，以盡可能避免重復(fù)采集同一克隆。將個體植株葉片采下后立刻放入事先準(zhǔn)備好的裝有約半袋硅膠的自封袋里，使葉片與硅膠充分混合，以便快速脫水。帶回實(shí)驗(yàn)室后根據(jù)實(shí)際情況更換已經(jīng)變色的硅膠，葉片干燥后，每一種群隨機(jī)選取9～13個樣本分別提取DNA。

表1 互花米草采樣地點(diǎn)Table 1 Localities of S.alterniflora populations

1.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增

使用BioFlux公司的植物基因組DNA提取試劑盒（Biospin plant genomic DNA extraction Kit）從硅膠干燥的葉片中提取DNA。本研究使用Taberlet等［16］設(shè)計(jì)的通用引物對來自8個種群的80個樣本的葉綠體trnT－trnL和trnL－trnF基因間區(qū)序列進(jìn)行PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，polymerase chain reaction）擴(kuò)增和測序（2009年）。引物序列由上海生物工程技術(shù)有限公司生產(chǎn)合成（表2），其中PrimerA和PrimerB用于trnT－trnL區(qū)域的擴(kuò)增和測序；PrimerC和PrimerF用于trnL－trnF區(qū)域的擴(kuò)增，PrimerC、PrimerD和PrimerF用于該序列的測序。PCR擴(kuò)增在Biometra Thermoblock T－1上完成，擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL，包括模板DNA（20～40ng／μL）1μL、Primer（10μmol／L）各0.8μL、10×LA PCR Buffer II（Mg2＋Free）2μL、dNTP Mixture（2.5mmol／L）3.2μL、MgCl2（25mmol／L）2 μL、TaKaRa LA Taq（5U／μL）0.2μL、ddH2O 10μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性45s，53℃退火30s，72℃延伸1.5min，共35個循環(huán)，最后再72℃ 延伸5min，4℃ 保存。

1.3 目的片段的檢測、純化和序列測定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳檢測，確定為目的條帶且無雜帶干擾后使用上海捷倍思基因技術(shù)有限公司的PCR clea－up Kit直接清潔PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物濃度達(dá)到測序要求后，送至華大基因科技股份有限公司上海測序部直接雙向測序。測序峰圖明確、無雜峰的序列測序1次，對部分序列進(jìn)行2～3次重復(fù)擴(kuò)增、測序。

1.4 序列拼接、比對和分析數(shù)據(jù)處理

所得的序列用Sequencher 4.8進(jìn)行拼接并根據(jù)峰圖進(jìn)行手工校正，然后利用Mega中的ClustalW模塊進(jìn)行對位排列。使用DnaSP 5.10計(jì)算單倍型多樣性（Hd）、固定指數(shù)Fst和種群間基因分化系數(shù)Gst。固定指數(shù)Fst根據(jù)公式Fst＝1／（1＋2Nm）計(jì)算得出，式中，N是雌性有效種群大小，m是雌性遷移率［18］；種群間基因分化系數(shù)Gst根據(jù)公式Gst＝1／｛1＋4N［（m＋v）s／（s－1）］｝計(jì)算得出，式中，N是有效群體大小，m是每世代遷移率，s為亞群體的數(shù)目，v為每世代的突變速率［19］。使用GenAlEx6計(jì)算Nei遺傳距離（D）及遺傳一致度（I），分子方差分析（AMOVA）計(jì)算種群內(nèi)、種群間的變異方差分布，并在MEGA上基于Nei遺傳距離得到UPGMA聚類圖。

表3 中國互花米草cpDNAtrnT－trnF單倍型Table 3 The variation sites of indel in cpDNA trnT－trnFsequence of S.alterniflora

2 結(jié)果與分析

2.1 中國互花米草葉綠體trnT－trnL 和trnL－trnF片段序列特點(diǎn)

經(jīng)擴(kuò)增、測序，部分樣品重復(fù)擴(kuò)增測序驗(yàn)證，利用PrimerA和PrimerB，共獲得80條trnT－trnL基因間區(qū)序列，經(jīng)序列比對，兩端切平后，獲得的序列絕對長度為772～773bp，平均核苷酸組成為：C 11.4%；T 33.1%；A 40.4%；G 15.1%，C＋G含量26.5%，在這一組序列中，沒有發(fā)現(xiàn)核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，只發(fā)現(xiàn)了2個單堿基A的插入／缺失（indel）位點(diǎn)（單個核苷酸的插入／缺失算一次indel事件），分別在序列140和525 bp位置上。在中國種群內(nèi)，利用PrimerC和PrimerD擴(kuò)增得到的trnL－trnF序列中未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)，經(jīng)排序后，兩端切平，得到1 004bp的整齊序列，序列堿基組成為 A：34.4%，G：17.0%，C：17.2%，T：31.4%，G＋C含量：34.2%。將測序所得的trnT－trnL序列與trnL－trnF序列拼接成trnT－trnF序列。2個單堿基A的插入／缺失將80條trnT－trnF序列分為3種單倍型，即H1～H3（表3）。在8個中國種群中各單倍型的分布情況不同（圖1，表4），其中羅源 （LY）種群中單倍型種類最多，為3種，其次塘沽 （TG）、射陽 （SY）、大豐（DF）、崇明（CM）種群均為2種，寧波（NB）和樂清（LQ）種群最少，只有1種?？梢园l(fā)現(xiàn)，每一種單倍型均為多個種群所共有；其中H3型分布最為廣泛，在各個種群中均有分布，其在總樣本中發(fā)生的頻率為77.6%（62條序列）；H1型分布于塘沽、射陽和羅源種群，H2型分布于朱旺、大豐、崇明和羅源種群，2種單倍型均占總樣本的11.2%（圖1）。

Blum等［20］根據(jù)互花米草cpDNAtrnT－trnF非編碼區(qū)的序列差異將來自北美大西洋沿岸到墨西哥海灣及太平洋沿岸30個地區(qū)的598個樣本分為42種單倍型（GenBank登錄號：AY927278～AY927299、DQ486839～DQ486858），聚類為A、B、C和D四個大群，其中我國互花米草原產(chǎn)地北卡羅萊納州、喬治亞和佛羅里達(dá)州的互花米草種群包含C、D兩個大群的單倍體型，以C型互花米草為主。將所得的中國互花米草trnT－trnF序列同美國互花米草trnT－trnF單倍型序列進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)H1、H2、H3單倍型分別與美國互花米草單倍型C1、C2和C4序列一致，與Blum等［20］的研究相比較，未發(fā)現(xiàn)新的單倍型。

2.2 中國互花米草cpDNAtrnT－trnF序列的Indel多樣性和單倍型多樣性

8個種群總樣本的單倍型多樣性Hd值為0.379，除寧波和樂清種群外，各種群的Hd值介于0.282～0.639，其中羅源種群具有最高的單倍型多樣性（0.639），塘沽和崇明種群次之（0.533）（表5）。寧波和樂清種群均只存在H3單倍型。

2.3 中國互花米草種群遺傳多樣性

互花米草種群內(nèi)和種群間遺傳差異分別為91%和9%（表6），說明互花米草的遺傳多樣性主要體現(xiàn)在種群內(nèi)部，各種群之間雖然存在一定的差異，但種群間遺傳分化較少，這與Fst值分析結(jié)果一致（表7）。根據(jù)cp－DNAtrnT－trnF非編碼區(qū)序列變異估算出種群間基因分化系數(shù)Gst（0.103）、固定指數(shù)Fst（0.092），表明互花米草種群之間的分化程度較小。但是將種群兩兩比較，發(fā)現(xiàn)各種群間的Fst存在一定差異（0.017～0.333）。

各種群間的遺傳距離（Nei distance，D）和遺傳一致度（I）分析表明（表8），互花米草各種群的遺傳距離平均為0.064，其中距離最大的為崇明與寧波、樂清種群之間（0.184），距離最小的為寧波與樂清種群之間（0.000）。同樣的，互花米草各種群間的遺傳一致度平均值為0.940，其中最高的為寧波與樂清種群之間（1.000），最低的為崇明與寧波、樂清種群之間（0.832）。朱旺種群與其他種群之間的遺傳距離和遺傳一致度與其他種群之間的差異較大。根據(jù)得到的遺傳距離數(shù)據(jù)，使用非加權(quán)配對平均聚類法（UPGMA），對這8個種群進(jìn)行聚類（圖2），發(fā)現(xiàn)崇明種群與其他7個種群的遺傳距離最大，寧波與樂清種群，朱旺與大豐種群，塘沽和羅源種群遺傳距離較近。

圖1 中國沿海8個互花米草種群cpDNAtrnT－trnF單倍型分布及頻率Fig.1 The distribution and frequency of cpDNAtrnT－trnFhaplotypes among eight populations of S.alterniflorain China

表4 中國互花米草種群中cpDNAtrnT－trnF單倍型分布Table 4 The distribution of cpDNAtrnT－trnFhaplotypes among S.alterniflorain China

3 討論

3.1 中國互花米草種群受遺傳瓶頸效應(yīng)影響

互花米草最早于1979年由南京大學(xué)從美國東南部的北卡羅萊納州、喬治亞和佛羅里達(dá)州引種進(jìn)入中國。在這3個州，Blum等［20］一共發(fā)現(xiàn)11種cpDNAtrnT－trnF單倍型，這3個州的互花米草種群均由多種單倍型組成，其中單倍型C2、C3、C4和C5是主要的類群。本研究結(jié)果表明，在8個中國互花米草種群中共發(fā)現(xiàn)3種cpDNAtrnT－trnF單倍型，分別對應(yīng)于美國的C1，C2和C4三種單倍型。葉綠體trnT－trnF非編碼區(qū)序列在種內(nèi)具有一定的分辨能力，但葉綠體基因組屬于單親遺傳，結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定，極少或者不發(fā)生重組和種內(nèi)變異。在中國互花米草種群中，未發(fā)現(xiàn)有別于美國原產(chǎn)地的新的cpDNAtrnT－trnF單倍型，這說明在短短30年內(nèi)，中國互花米草葉綠體基因組可能并未發(fā)生太多改變。中國沿?；セ撞莘N群多樣性低于美國原產(chǎn)地種群，說明在cpDNAtrnT－trnF序列區(qū)域，中國沿?；セ撞莘N群受到明顯的瓶頸效應(yīng)（genetic bottleneck）影響。這與沈棟偉［21］利用微衛(wèi)星位點(diǎn)研究中國沿?；セ撞莘N群遺傳結(jié)構(gòu)的結(jié)果一致。

互花米草在福建羅源的單倍型多樣性高于浙江、上海、江蘇、山東、天津種群，這在一定程度上揭示了中國沿?；セ撞莸膫鞑ヂ窂??；セ撞輳拿绹N進(jìn)入我國后，首先于1980年10月在福建羅源進(jìn)行了大規(guī)模的繁殖試種，從1982年開始，逐漸向江蘇和其他地方引種［2］。由于遺傳瓶頸效應(yīng)，導(dǎo)致從羅源到中國其他地區(qū)的互花米草種群單倍型多樣性減小，這與預(yù)期結(jié)果一致。

表5 中國互花米草種群cpDNAtrnT－trnF序列Indel多樣性和單倍型多樣性Table 5 The Indel diversity and Indel haplotype diversity of cpDNAtrnT－trnFsequence of S.alterniflora among 8populations in China

表6 互花米草種群基于cpDNAtrnT－trnF的分子變異方差分析Table 6 Analysis of molecular variance（AMOVA）for eight populations of S.alterniflorabased on cpDNAtrnT－trnFregion

表7 估計(jì)的互花米草種群間遺傳分化（Fst）Table 7 Estimates of genetic differentiation（Fst）between eight populations of S.alterniflorain China

3.2 中國互花米草cpDNAtrnT－trnF單倍型的地理分布

本研究對中國沿海從福建羅源（北緯26°）到天津（北緯38°）8個種群的互花米草樣本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)H3單倍型（對應(yīng)于Blum等［20］的C4單倍型）在所有種群中均有分布，且在各種群中分布頻率占明顯優(yōu)勢；H2單倍型（對應(yīng)于Blum等［20］的C2單倍型）在福建、山東、江蘇和上海均有分布（北緯26°～37°）。這與美國互花米草種群的情況一致，Blum等［20］觀察到美國東海岸互花米草A、B單倍型分布于中北部；D單倍型分布于中南部；C類單倍型分布范圍最廣，其中C4單倍型分布最廣，從南部的佛羅里達(dá)州（北緯24°～30°）到北部的緬因州（北緯43°～47°）均有分布，C2單倍型分布也較廣，從南部的佛羅里達(dá)州 （北緯24°～30°）到北部的紐約州（北緯40°～45°）均有分布。而引種進(jìn)入中國的恰好是分布范圍最為廣泛的C單倍型，這可能也是互花米草在中國沿海迅速擴(kuò)張的原因之一。

H1單倍型（對應(yīng)于Blum等［20］的C1單倍型）在福建、江蘇和天津（北緯26°～38°）均有分布，80個樣本中一共發(fā)現(xiàn)了9例C1單倍型。Blum等［20］一共分析了30個種群共598份樣品，僅在南卡羅萊納州發(fā)現(xiàn)1例C1單倍型，在中國互花米草的原產(chǎn)地北卡羅萊納州、喬治亞和佛羅里達(dá)3個州未發(fā)現(xiàn)該單倍型。Blum等［20］在這3個州的6個種群中一共分析了70個樣本，取樣數(shù)的限制可能導(dǎo)致他們在這3個州未發(fā)現(xiàn)稀有的C1單倍型。這種在非本土種群中發(fā)現(xiàn)稀有等位基因或其頻率上升的現(xiàn)象是有先例的。如在中華絨螯蟹 （Eriocheirsinensis）的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)引入歐洲的種群中最普遍的線粒體DNA單倍型，同時也是在美國加利福尼亞種群中發(fā)現(xiàn)的唯一單倍型，并沒有在原產(chǎn)地種群中發(fā)現(xiàn)［22］；在美國的互花米草種群中也發(fā)現(xiàn)在引種地頻率較低的單倍型在舊金山海灣內(nèi)的頻率明顯升高［20］。這種單倍型頻率發(fā)生顯著改變的現(xiàn)象可能是由于引種時的遺傳瓶頸以及小種群的遺傳漂變引起的。

表8 Nei遺傳一致度（對角線上）和遺傳距離（對角線下）Table 8 Nei’s genetic identity（I，above diagonal）and genetic distance（D，below diagonal）between eight populations of S.alterniflorain China

圖2 互花米草8個種群基于Nei’s遺傳距離的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram for 8populations of S.alterniflorabased on Nei’s genetic distance

4 結(jié)論

通過分析我國互花米草種群cpDNAtrnT－trnF序列變異，可知中國互花米草種群受瓶頸效應(yīng)影響明顯，3種cpDNAtrnT－trnF單倍型在美國原產(chǎn)地均有發(fā)現(xiàn)，其cpDNAtrnT－trnF單倍型多樣性遠(yuǎn)低于美國原產(chǎn)地；我國互花米草亦以在美國東海岸分布最為廣泛的cpDNAtrnT－trnFC4單倍型為主（占77.5%）；互花米草種群間遺傳變異較低，種群內(nèi)多樣性相對較高。由于葉綠體基因組屬于單親遺傳，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，進(jìn)化較慢，提供的信息有限，今后將選取進(jìn)化速率更快的核基因組位點(diǎn)進(jìn)一步分析種群的遺傳結(jié)構(gòu)和進(jìn)化機(jī)制。

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