王 萌,向極釬，汪李平,殷紅清,馬 進

(1.恩施清江生物工程有限公司，湖北 恩施 445000；2.華中農業(yè)大學 園藝林學學院，湖北 武漢 430070)

根用芥菜(Brassicajunceavar.megarrhizaTsen et Lee)又名大頭菜，屬我國特產蔬菜.我國大頭菜育種相對比較落后，嚴重地制約著生產的發(fā)展.利用花藥培養(yǎng)技術可以加速育種進程.花藥培養(yǎng)技術發(fā)展迅速,特別是在十字花科作物上，已成為重要的育種手段，而在根用芥菜上，相關的研究很少[1-2].

本研究旨在探索根用芥菜花藥培養(yǎng)過程中最適培養(yǎng)基、激素、預冷時間、熱激時間等，建立其較為完善的花藥培養(yǎng)胚狀體誘導體系，從而獲得DH系，加速育種進程.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以著名地方品種-襄樊獅子頭芥菜(大頭菜)為材料.采取常規(guī)栽培管理，株現(xiàn)蕾后，摘取健壯無病蟲的花蕾進行試驗.丟棄有病、有蟲、畸形、開裂、柱頭外露的花蕾，去除過大和過小的花蕾，花序上僅保留2.0～3.0 mm長度的花蕾(小孢子處于單核靠邊期見封二圖版4).將處理好的花序用濕紗布包裹放入培養(yǎng)皿中，置于4℃冰箱.

1.2 試驗方法

將處理好的花序先在自來水下沖洗30 min，在超凈工作臺上，依次使用 75%的酒精滅菌30 s，0.1%的升汞滅菌10 min，無菌水清洗3次.在無菌濾紙上用尖頭鑷子輕輕剝開花蕾，取出花藥，接種于培養(yǎng)基上，蓋上培養(yǎng)皿，用parafilm膜封口.剝取花藥時要盡量少傷及花藥，盡量不要帶花絲.在隔水式恒溫培養(yǎng)箱中進行熱激處理一定的時間后，轉入25℃條件下黑暗靜置培養(yǎng)，4周后統(tǒng)計胚狀體誘導率.培養(yǎng)基瓊脂含量為0.8%，pH5.8，121℃高溫濕熱滅菌[3].

1.2.1 不同培養(yǎng)基對出胚率的影響 不同的培養(yǎng)基在花藥培養(yǎng)試驗中報道結果不一，而且花藥培養(yǎng)成功的報道相對較多.而在大頭菜游離小孢子培養(yǎng)上報道較少，花藥培養(yǎng)尚未見報道.所以本實驗選用在十字花科作物上使用較多的MS、B5和改良的Keller培養(yǎng)基[4-6].其中MS、B5的蔗糖濃度為6%，改良Keller蔗糖濃度為10%[7].

1.2.2 激素對出胚率的影響 將花藥接種于添加1 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的Keller-10培養(yǎng)基中，以不添加激素的Keller-10為對照[8]，4周后統(tǒng)計不同處理間胚狀體誘導率的差異.

1.2.3 預冷天數對出胚率的影響 將挑選好的花序用濕紗布包好放入4℃的冰箱進行預冷處理，處理天數分別為0、1、3、5 d，達到預定時間后取出進行花藥培養(yǎng)，以不進行預冷處理為對照.

1.2.4 熱激天數對出胚率的影響 花藥接種后放入32.5℃恒溫箱中進行熱激處理，熱激處理處理時間分別為0、1、2 d，處理結束后轉入25℃恒溫箱中進行黑暗培養(yǎng).

上述試驗的每個處理中，平均每個培養(yǎng)皿接種4個花蕾，每個處理10皿，兩次重復.

表1 不同培養(yǎng)基對花藥胚胎發(fā)生的影響

表2 激素對花藥胚胎發(fā)生的影響

表3 預冷天數對花藥胚胎發(fā)生的影響

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基對出胚率的影響

本試驗中，MS-6和B5-6兩種培養(yǎng)基上沒有獲得胚狀體，由表1得出結論，Keller-10培養(yǎng)基更適合進行大頭菜的花藥培養(yǎng).實驗中我們觀察到，當花藥從花蕾中剝出時，花藥呈黃綠色，接種后3 d左右，花藥變?yōu)榱咙S色，稍微膨大，多數花藥有明顯的彎曲現(xiàn)象；隨后花藥的顏色慢慢變?yōu)辄S褐色至褐色.大約3周后，某些花藥上會有白色的針狀物刺破花藥壁鉆出，這些就是子葉胚的雛形，子葉胚自胚根伸出后發(fā)育較快，約一周的時間就可看到完整的子葉胚(見封二圖版5).

2.2 激素對出胚率的影響

由表2可以得出在添加激素的培養(yǎng)基中無胚狀體產生，Keller-10培養(yǎng)基不添加激素更適合進行大頭菜花藥培養(yǎng).在實驗中發(fā)現(xiàn)，添加激素的培養(yǎng)基中，帶有花絲的花藥多數都有膨大現(xiàn)象，另外，在花藥上特別是花藥與花絲的斷口處，常常形成一團白色半透明的愈傷組織，在接種的初期，愈傷生長很快，到后期慢慢褐化死亡.

2.3 預冷天數對出胚率的影響

由表3可以得出4℃處理5 d與處理3 d在對胚狀體的誘導上存在顯著差異，處理5 d的誘導率最低，預冷0、1、3 d三種處理之間在出胚總數和出胚率上存在差異，但是這種差異沒有達到顯著水平，所以4℃低溫處理花序0、1、3 d都有較好的出胚率，低溫處理3 d時，出胚率最高.

2.4 熱激天數對出胚率的影響

熱激處理的目的在于從外界給予花藥內的小孢子一種刺激，促使它的發(fā)育途徑偏轉，由配子體發(fā)育轉到孢子體發(fā)育途徑上.在不同的物種，不同的種、品種間最適的熱激的時間都不太一致，但多數認為熱激處理是有效的.由表4可以看出，在本試驗中也得出相似的結論，32.5℃熱激處理1、2 d與不進行熱激處理之間在出胚誘導上存在顯著差異，熱激處理1 d和2 d之間沒有顯著差異，但熱激處理2 d稍好.

表4 熱激天數對花藥胚胎發(fā)生的影響

3 結論與討論

通過比較MS、B5和改良Keller三種培養(yǎng)基對出胚率的影響，得出改良Keller更適合根用芥菜花藥培養(yǎng).在試驗中觀察到MS-6和B5-6培養(yǎng)基上接種的花藥與在Keller-10上培養(yǎng)的花藥相比，沒有明顯的不同，這可能是花藥內的小孢子沒有脫分化或者脫分化后發(fā)育在某個階段停止，沒有刺破花藥壁鉆出.另外還觀察到如果接種的花藥帶有花絲，則很多花藥膨大很明顯(見封二圖6～7)，甚至在花藥的某個部位劇烈膨漲，呈半透明狀，這些花藥最終褐化死亡，沒有胚狀體產生，所以在接種時盡量去掉花絲.改良Keller與其他兩種培養(yǎng)基最明顯的差別在于Keller配方中大量元素的含量低，有機成分含量很高，在試驗中，三種培養(yǎng)基在蔗糖濃度上也有較大差別，出胚率的差異是由哪個因素造成還有待進一步研究.

通過比較不同預冷時間對花藥培養(yǎng)過程中出胚率的影響，得出4℃處理花蕾3 d最好，這一結果與前人的研究結果比較一致.4℃處理3 d出胚率最高，但3 d內對出胚率的影響差異不大，所以低溫處理更實際的用途在于暫時保存花蕾，低溫處理時間超過5 d，花蕾萎蔫對出胚不利.

通過比較是否添加6-BA和NAA對出胚率的影響，得出激素的添加不利于花藥的出胚，這可能與添加的激素種類、濃度不合適有關，也可能是由于激素的添加導致體細胞增殖，消耗了營養(yǎng)物質和花藥本身的內源物質，抑制了小孢子的脫分化或發(fā)育進而影響了出胚.激素對出胚率的影響還有待進一步研究.

[1] 陳玉萍，田志宏，陳愛武,等.包心芥菜游離小孢子培養(yǎng)的初步研究[J].華中農業(yè)大學學報,1998，17(1)：97-99.

[2] 劉冬，郭平仲，劉凡,等.芥菜(Brassica juncea L.)小孢子胚發(fā)生和植株再生[J].首都師范大學學報：自然科學版,1997,18(1)：79-84.

[3] 王濤濤.蕓薹屬蔬菜小孢子培養(yǎng)及自交不親和性的分子鑒定[D].武漢：華中農業(yè)大學,2006.

[4] 宋寶香，馮輝，楊春喜.基本培養(yǎng)基和蔗糖濃度在大白菜花藥培養(yǎng)中對胚狀體誘導的影響[J].中國農學通報,2006,21(11):45-46.

[5] 王超楠，馮輝，姜鳳英,等.羽衣甘藍花藥培養(yǎng)胚狀體誘導初報[J].中國蔬菜,2006(6):23-24.

[6] 許忠民，張恩慧，歐承剛,等.不同因素對甘藍花藥愈傷組織誘導的影響[J].西北農林科技大學學報：自然科學版, 2006,34(9):71-74.

[7] 梅時勇，楊保國，姚芳,等.蘿卜花藥培養(yǎng)試驗[J].中國蔬菜,2002(1)：35-36.

[8] 袁惠燕，侯喜林.溫度預處理對不結球白菜雜種F1花藥培養(yǎng)[J].南京農業(yè)大學學報,2008,31(4):144-148.