黃雅靜，黃銳，錢英子，周智*

(1.重慶市口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)研究中心，重慶401147;2.重慶醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，重慶401147)

齲病是兒童最常見(jiàn)的一種口腔疾病，兒童齲病的發(fā)生可導(dǎo)致乳牙疼痛、早失甚至恒牙的萌出，嚴(yán)重影響兒童口腔健康、生理發(fā)育及心理健康。生態(tài)菌斑學(xué)提出牙菌斑的組成細(xì)菌是口腔內(nèi)的正常菌群，正常狀態(tài)下，各細(xì)菌之間以及細(xì)菌與宿主之間處于平衡狀態(tài)，一旦口腔內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，如頻繁攝入碳水化合物或唾液流量減少等可使牙菌斑長(zhǎng)期處于低pH值環(huán)境，有利于變形鏈球菌、乳酸桿菌等耐酸菌的過(guò)度生長(zhǎng)，而血鏈球菌、口腔鏈球菌等生長(zhǎng)受到抑制，各種細(xì)菌間的比例改變，微生態(tài)平衡失調(diào)，這種情況下脫礦大于再礦化，導(dǎo)致齲病的發(fā)生。以往有多項(xiàng)研究表明乳酸桿菌(Lactobacilli，LB)及變形鏈球菌(Streptococcus mutans，MS)具有密切相關(guān)性，是兒童齲齒最主要的致齲菌［1］。生態(tài)菌斑學(xué)說(shuō)是解釋關(guān)于齲病病因?qū)W的重要假說(shuō)，其基本思想是:環(huán)境因素的改變可以引起口腔內(nèi)微生態(tài)平衡的破壞，即導(dǎo)致定植于口腔中正常的菌群組成及比例失調(diào)，從而引發(fā)齲病的發(fā)生。變形鏈球菌(MS)和乳酸桿菌(LB)是口腔中的常駐菌，屬口腔常駐細(xì)菌，對(duì)于口腔菌斑微生態(tài)平衡起著重要作用，變形鏈球菌是口腔內(nèi)公認(rèn)的主要致齲菌［2］，但是乳酸桿菌多年來(lái)一直是學(xué)者們爭(zhēng)議的話題，且關(guān)于齲病發(fā)生中乳酸桿菌與變形鏈球菌的相互關(guān)系，不同的研究所得出的結(jié)論也不盡一致。本研究擬定量分析不同齲敏感情況下兒童口腔檢出情況，探討二者相關(guān)性，揭示其臨床意義，以期為開(kāi)展微生態(tài)學(xué)防齲提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料ROGOSA培養(yǎng)基，MSB培養(yǎng)基，微量生化反應(yīng)試劑。

1.1.2 病例選擇年齡＜12歲的受試者共164人，納入標(biāo)準(zhǔn)［3］:①受試者要求無(wú)明顯的牙周病癥狀;②未做過(guò)窩溝封閉;③無(wú)牙齒結(jié)構(gòu)異常;④未戴牙齒矯治器者;⑤檢查前1 h內(nèi)未進(jìn)食;⑥1個(gè)月內(nèi)未服用過(guò)抗生素，半年內(nèi)未服用過(guò)激素和免疫抑制劑，1個(gè)月內(nèi)無(wú)口腔局部用藥及漱口水;⑦全身無(wú)重大系統(tǒng)疾病的患者。符合納入標(biāo)準(zhǔn)的受試者共100人，根據(jù)齲敏感程度［3］分為無(wú)齲組(DMFS=0)50人，高齲組(DMFS≥6)50人;變異鏈球菌采用MSB培養(yǎng)基，乳酸桿菌采用Rogasa培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集及處理采樣均由同一個(gè)檢查者完成:①唾液樣本的采集，收集患兒非刺激性全唾液1 mL于滅菌干燥后的離心管內(nèi);②菌斑樣本的采集:唾液取樣后無(wú)菌生理鹽水漱口3次，去除口內(nèi)的食物殘?jiān)?，消毒棉球隔濕。采集部?無(wú)齲組取光滑面、窩溝的集合牙菌斑，并分別放入滅菌干燥后含硫乙醇酸鈉溶液的容器內(nèi);高齲組取光滑面及窩溝，深層齲壞牙本質(zhì)的集合牙菌斑，并分別放入含硫乙醇酸鈉溶液的容器內(nèi)。送往實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)旋渦混勻儀振蕩1 min，用滅菌林格氏液及硫乙醇酸鈉分別10倍系列稀釋唾液和菌斑，2 h內(nèi)完成接種。

1.2.2 細(xì)菌初代培養(yǎng)取唾液及菌斑原濃度、10-1、10-2、10-3稀釋液各20 μL，分別接種于MSBA以及ROGOSA培養(yǎng)平板，80%N2、10%H2、10%CO2，37℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落檢測(cè)和鏡檢細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定。菌落檢測(cè)及細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定:肉眼觀察可見(jiàn)MSB平板上典型變形鏈球菌菌落為粗糙型，高凸，深藍(lán)色嵌頓于瓊脂內(nèi)，質(zhì)硬，邊緣不整齊，表面呈玻璃樣。經(jīng)革蘭染色，油鏡(10×100)下可見(jiàn)變形鏈球菌菌落為G+小球菌，呈長(zhǎng)鏈狀或短鏈狀，成隊(duì)或分散排列。在Rogosa培養(yǎng)基上乳酸桿菌菌落為白色或灰白色，表面光滑，軟而突起，直徑針尖大小到2 mm左右。經(jīng)革蘭染色，顯微鏡下見(jiàn)乳酸桿菌為G+桿菌，長(zhǎng)桿狀、短桿狀或棒狀，菌落呈圓丘狀，不透明，干酪樣白色，單個(gè)、成對(duì)或成串排列。

1.2.3 細(xì)菌生化反應(yīng)收集部分變形鏈球菌菌落用微量生化板法進(jìn)行甘露醇、山梨醇、棉子糖、蜜二糖、七葉苷以及精氨酸的生化鑒定;收集部分乳酸桿菌菌落用微量生化板法進(jìn)行葡萄糖、乳糖、蔗糖、硝酸及H2O2生化鑒定。

1.2.4 細(xì)菌次代純化培養(yǎng)將甘油保種的變形鏈球菌臨床分離株分別接種于MSB培養(yǎng)平板內(nèi);甘油保種的乳酸桿菌臨床分離株分別接種于Rogosa培養(yǎng)平板內(nèi)，培養(yǎng)條件同細(xì)菌初代培養(yǎng)。根據(jù)菌落形態(tài)挑取變形鏈球菌屬及乳酸桿菌屬單菌落，每個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象隨機(jī)挑取3～9個(gè)顯示不同形態(tài)的菌落，劃線轉(zhuǎn)種于TSA平板進(jìn)行次代培養(yǎng)，80%N2、10%H2、10%CO2，37℃培養(yǎng)48 h，獲得純培養(yǎng)后做進(jìn)一步鑒定。將鑒定結(jié)果為陽(yáng)性者，分別置于50%甘油BHI和Rogosa液體保種、備用。1.2.5統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，細(xì)菌檢出率的比較用卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05表示有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果、菌落形態(tài)、細(xì)菌形態(tài)以及生化鑒定結(jié)果，高齲、無(wú)齲兒童各主要致齲菌的檢出情況見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，高齲組變形鏈球菌(88%)和乳酸桿菌(76%)的檢出率均高于無(wú)齲組相應(yīng)細(xì)菌(26%、28%)的檢出率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。由表2可見(jiàn)，納入標(biāo)準(zhǔn)的高齲組受試者50人中有38例患者檢出乳酸桿菌，其中于齲壞深層檢出例數(shù)為38例，光滑面、窩溝、唾液檢出例數(shù)依次為20、24、20例;檢出變形鏈球菌的病例數(shù)為44例，其中于齲壞深層檢出例數(shù)為23例，光滑面、窩溝，唾液檢出例數(shù)依次為42、34、39例;納入標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)齲組受試者50人中檢出乳酸桿菌病例數(shù)為14例，窩溝、光滑面檢出病例數(shù)均為12例，唾液均檢出10例，檢出變形鏈球菌病例數(shù)為13例，光滑面檢出病例數(shù)為11例，窩溝、唾液依次檢出13、10例。根據(jù)x2檢驗(yàn)分析得齲壞乳酸桿菌檢出率與窩溝、光滑面乳酸桿菌檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 不同部位乳酸桿菌、變形鏈球菌檢出情況Table 1 Detection Lactobacilli and Streptococcus mutans in different sites

表2 不同齲敏感組間乳酸桿菌、變形鏈球菌檢出情況Table 2 Detection Lactobacilli and Streptococcus mutans between different DMFS groups

對(duì)各組細(xì)菌檢出情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯示高齲組變形鏈球菌、乳酸桿菌的檢出率與無(wú)齲組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且齲敏感度DMFS與細(xì)菌的檢出率有關(guān)。

3 討論

MSB是一種分離變形鏈球菌最佳的選擇性培養(yǎng)基，能夠抑制遠(yuǎn)緣鏈球菌的生長(zhǎng)，變形鏈球菌在該瓊脂培養(yǎng)基上能夠形成較有鑒別意義的菌落形態(tài)［4］;Rogosa培養(yǎng)基是乳酸桿菌選擇培養(yǎng)基，因其具有較低的pH值(5.0左右)，對(duì)乳酸桿菌具有較強(qiáng)選擇性，除乳酸桿菌外，其他口腔細(xì)菌不能生長(zhǎng)［5］。

乳酸桿菌屬細(xì)菌是一群專性或兼性厭氧菌，口腔流行病學(xué)中將乳酸桿菌視為“齲標(biāo)志菌”，通過(guò)對(duì)乳酸桿菌的檢測(cè)，從而預(yù)測(cè)齲病的進(jìn)展趨勢(shì)。乳酸桿菌的致齲性主要表現(xiàn)在產(chǎn)酸性和耐酸性。細(xì)菌發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)酸，是使牙體組織脫礦的直接原因。各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了細(xì)菌的產(chǎn)酸性與其致齲性密切相關(guān)。乳酸桿菌并不是齲病開(kāi)始的必須條件，但是其對(duì)齲損的發(fā)展卻起著重要的作用，主要是因?yàn)槿樗釛U菌能夠發(fā)酵糖類，產(chǎn)生有機(jī)酸，從而使牙體表面pH降低，導(dǎo)致釉質(zhì)脫礦，如不及時(shí)采取防齲修復(fù)措施，則會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致齲損的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示:高齲組中乳酸桿菌和變形鏈球菌的檢出率明顯高于無(wú)齲組(P＜0.05)，且乳酸桿菌、變形鏈球菌的檢出率與齲敏感度DMFS有相關(guān)性。此外乳酸桿菌在齲損牙本質(zhì)深層的檢出率高于光滑面、窩溝處菌斑及唾液乳酸桿菌檢出率(P＜0.05)，說(shuō)明高齲人群口腔內(nèi)環(huán)境由于乳酸桿菌的存在使pH降至更低，更適合乳酸桿菌和變形鏈球菌等耐酸致齲菌的黏附、增殖，從而大量產(chǎn)酸，進(jìn)一步抑制其他不耐酸的致齲菌，此外齲損內(nèi)為微生物提供了保護(hù)并形成新的滯留區(qū)域。同時(shí)損害部位提供齲損崩解物或滯留物，pH值更低，有利于乳酸桿菌的增殖;而齲損深層變形鏈球菌的檢出率卻低于其在光滑面及窩溝處的檢出率，由于齲壞深層環(huán)境pH低于變形鏈球菌的適宜生存環(huán)境(最適宜pH為7.2)，不利于變形鏈球菌的生存，且乳酸桿菌具有一定的抑菌特性，對(duì)變形鏈球菌也具有一定的抑制特性，因此出現(xiàn)齲壞深層變形鏈球菌的檢出率低于其他部位。

以往關(guān)于唾液、菌斑中乳酸桿菌、變形鏈球菌的檢出情況與齲壞程度相關(guān)性研究，不同研究者就微生物檢出情況與齲病的流行性給出的研究結(jié)果不甚一致［6］。有研究［7-9］認(rèn)為齲損指數(shù)與微生物的檢出情況具有緊密相關(guān)性，尤其在形成釉質(zhì)齲損后，更為顯著。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)乳酸桿菌可預(yù)測(cè)齲進(jìn)展情況;而另有一些研究［6，10］卻不能說(shuō)明齲敏感指數(shù)與微生物檢出情況的相關(guān)性。本研究結(jié)果也證明了DMFS與乳酸桿菌、變形鏈球菌檢出情況的相關(guān)性。

鑒于本實(shí)驗(yàn)研究目前所取的實(shí)驗(yàn)樣本例數(shù)尚少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在一定的偏倚性，故尚需加大試驗(yàn)樣本量。此外本研究亦有不足之處:如未涉及有齲人群中細(xì)菌的分離情況，以及未對(duì)分離菌的產(chǎn)酸情況進(jìn)行檢測(cè)，故將進(jìn)一步追加對(duì)有齲人群進(jìn)行乳酸桿菌、變形鏈球菌的分離及分離菌產(chǎn)酸情況的檢測(cè)。

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