李蓓，龍梅，郭放，何雪梅，鄒立扣，羅燕

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)都江堰校區(qū)微生物學(xué)實驗室，四川都江堰611830)

納豆激酶(nattokinase)是在納豆發(fā)酵過程中由納豆芽胞桿菌產(chǎn)生的具有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶。1987年日本的Sumi等［1］首次從納豆中提取出具有溶血栓作用的納豆激酶(nattokinase NK)，該酶能顯著分解血栓的主要成分—纖維蛋白，激活靜脈內(nèi)皮細胞產(chǎn)生纖溶酶原激活劑(t-PA)，從而增加內(nèi)源性纖溶酶的量及作用效果。納豆激酶可作為一種具有開發(fā)潛力的食品性溶栓藥物，源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品，安全性較高，隨著人民生活水平的提高，心血管疾病致死率不斷提高，納豆激酶產(chǎn)品具有溶栓效果好、可口服及半衰期長等特點，具有廣闊的應(yīng)用前景，鑒于此，本研究擬篩選出高酶活納豆激酶菌株，并對其分離純化，為納豆激酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵、產(chǎn)品的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株國內(nèi)外產(chǎn)納豆樣品，產(chǎn)納豆激酶Bacillus subtilis ZLK08菌株為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)都江堰校區(qū)微生物學(xué)實驗室分離獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自杭州微生物試劑有限公司。菌種分離培養(yǎng)基(%):葡萄糖0.5，蛋白胨1，牛肉膏0.5，酵母浸出物0.5，NaCl 0.5，瓊脂粉1.8，pH 7.0～7.2;種子液培養(yǎng)基(%):葡萄糖1，酵母浸出物1，MgSO4·7H2O 0.05，K2HPO4·3H2O 0.1，pH 7.0～7.2;發(fā)酵培養(yǎng)基(%):葡萄糖2，CaCl20.64，酵母浸出物0.74，K2HPO4·3H2O 0.1，MgSO4·7H2O 0.05，pH 7.0～7.2，藥品均為化學(xué)純。

1.1.3 試劑DNA分子量標準DL2000、dNTP及TaqDNA聚合酶等購自天根生化科技(北京)有限公司;蛋白質(zhì)低范圍分子量Marker，16S rDNA引物:27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R:5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'引物由上海Sangon生物工程公司合成;纖維蛋白原、凝血酶購自Sigma公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備Eppendorf微量移液器、Olympus顯微鏡、PCR儀(Bio-Rad)、層析儀(Biological LP，Bio-Rad)、高速冷凍離心機(Eppendorf 5804R，德國)、電泳儀DYY-2C型(北京市六一儀器廠)、電泳成像儀(Bio-Rad)、低溫冷凍柜BD25-5LT型(青島海爾特種電冰柜有限公司)、雙人單面凈化工作臺SW-SJ-2FD型(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，小型渦旋振蕩器、水浴鍋及電熱恒溫培養(yǎng)箱等。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)酶菌株的分離與培養(yǎng)取各來源的納豆制品，從中取2～5粒放入滅菌試管中并加入9 mL無菌生理鹽水，將菌懸液梯度稀釋，取少量各稀釋度的液體涂布于分離培養(yǎng)基表面，倒置培養(yǎng)皿于37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落特征，將獲得的菌株劃線于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取菌株接種至20 mL種子液培養(yǎng)基，37℃，170 r/min搖震培養(yǎng)18～24 h，至OD600=7～8時，按5%(體積比)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃，170 r/min搖震培養(yǎng)72 h。

1.2.2 菌株的鑒定挑取普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落，革蘭染色后顯微鏡下觀察其形態(tài)。PCR擴增體系50 μL，包括超純水41 μL，10×Buffer 5.0 μL，4×dNTP 1.0 μL，27F和1492R各1.0 μL，Taq酶0.5 μL用無菌牙簽挑取牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落作模板。每個反應(yīng)為30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，首次循環(huán)先在94℃預(yù)變性7 min，最后1次循環(huán)后在72℃延伸10 min，擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成相系統(tǒng)(Bio-Rad)觀察并保存。樣品送上海生工生物工程有限公司測序，將測序序列在GenBank中blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對，選取相關(guān)序列利用分子生物學(xué)軟件分析同源性，菌株確認后用于下步實驗。

1.2.3 納豆激酶酶活測定納豆激酶的活性測定參照文獻［2-3］。首先，取0.4 mL濃度為0.72%的纖維蛋白原放入試管中，并加入0.1 mL 245 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)混勻，37℃孵育5 min，加0.1 mL 20 U/mL凝血酶溶液，37℃孵育10 min，加入0.1 mL稀釋酶液(發(fā)酵液)，繼續(xù)于37℃孵育60 min，分別于20、40 min搖勻1次，60 min后加入0.7 mL 0.2 mol/L TCA終止反應(yīng)，混合液經(jīng)10 000 r/min離心10 min后，于275 nm測定上清吸光度。1 unit(Fibrin degradation unit，F(xiàn)U)定義為275 nm每分鐘吸光度增加0.01的值。

1.2.4 納豆激酶的純化取種子培養(yǎng)液，4℃10 000 r/min離心10 min，取上清，65%硫酸銨過夜沉淀，4℃10 000 r/min離心20 min，取上清液，85%硫酸銨過夜沉淀，4℃10 000 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀溶于10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)中，充分溶解后透析過夜，聚乙二醇過夜?jié)饪s，Sephacryl S-200 HR凝膠過濾后收集，分別測定各管酶活。

1.2.5 納豆激酶SDS-PAGE分離膠濃度12.5%，濃縮膠濃度4.4%。經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，取1 mL培養(yǎng)液，離心取上清，10 000 r/min室溫離心5 min后，取20 μL上清液(純化酶液)加入等量的2×SDS加樣緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl pH 6.8，200 mmol/L DTT，4%SDS，0.2%溴酚藍，20%甘油)，沸水煮5 min，取10 μL上樣聚丙烯酰胺凝膠(4.4%的濃縮膠，12.5%的分離膠)。同時以誘導(dǎo)前樣品作為對照，觀察是否有新生蛋白帶出現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的鑒定

根據(jù)酶活測定結(jié)果，共篩選出產(chǎn)酶菌株6株，選取其中酶活最高、產(chǎn)酶穩(wěn)定菌株做形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明，選取的菌株在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落不透明，微黃色，整體易挑起或成絲狀，鏡檢為G+，成竹節(jié)狀，芽胞中端或偏生，不膨大(圖1)，液體培養(yǎng)基中生長時，形成菌醭。

圖1 Bacillus sp.ZLK08顯微鏡下特征Fig.1 Characteristic of Bacillus sp.ZLK08 under microscope

目前，16S rDNA已成功用于納豆激酶菌株的鑒定［4］。選取的菌株16S rDNA測序結(jié)果表明其長度為1 461 bp，(G+C)=55.3%。GenBank中序列比對顯示，其與BacillussubtilisT429(HQ441254)，B.subtilis Baws1(HQ711983)，Bacillus sp.DYJL24(HQ317164)，B.amyloliquefaciens NMSX4(GU568185)，B.amyloliquefaciens IMAUB1034(FJ641035)，B.methylotrophicus(HQ325853)，B.polyfermenticus bA8(JF772465)及B.subtilis BRZ4(GQ395246)的同源率均達到99%，據(jù)此，結(jié)合形態(tài)特征，確定此菌屬芽胞桿菌屬，命名為Bacillus sp.ZLK08。

2.2 產(chǎn)酶菌株的酶活測定

按5%(體積比)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃搖震培養(yǎng)72 h后取上清，反應(yīng)前纖維蛋白原凝固且不透明，反應(yīng)后纖維蛋白原被納豆激酶溶解且透明(圖2)，60 min于275 nm測定上清吸光度，結(jié)果表明其酶活達到2.5 FU/mL，與San-Lang等［3］報道相當(dāng)，可見Bacillus sp.ZLK08菌株具有較高納豆激酶活性，重復(fù)性試驗顯示Bacillus sp.ZLK08菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定。

圖2 納豆激酶反應(yīng)前后纖維蛋白原的變化Fig.2 The change of fibrinogen before and after reaction

2.3 納豆激酶的SDS-PAGE

圖3 上清液SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of supernatant

Bacillus sp.ZLK08菌株誘導(dǎo)后上清SDSPAGE見圖3。經(jīng)過硫酸銨鹽溶、鹽析后納豆激酶濃度增加，Sephacryl S-200 HR凝膠過濾后得納豆激酶單一條帶，經(jīng)分析分子量為28.46 ku，與Fujita M.［5］、Xin-mian H.等［6］報道相似。

圖4 純化納豆激酶SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE of purified nattokinase

3 討論

本研究成功獲得穩(wěn)定產(chǎn)酶的芽胞桿菌Bacillus sp.ZLK08，16S rDNA分析表明其與GenBank中序列同源率達到99%，液體發(fā)酵表明酶活達到2.5 FU/mL，SDS-PAGE表明納豆激酶分子量為28.46 ku?？梢姡蛛x出的Bacillus sp.ZLK08菌株能穩(wěn)定產(chǎn)納豆激酶且具有較高酶活，并可用于納豆激酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵及產(chǎn)品的研制。

［1］ Sumi H.，Hamada H.，Tsushima H.，et al.A novel fibrinolytic enzyme(nattokinase)in the vetetable cheese Natto:a typical and popular soybean food in the Japanese diet［J］.Experientia，1987，43(10):1110-1111.

［2］ Junguo Liu，Jianmin Xing，Tianshi Chang，et al.Optimization of nutritional conditions for nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using statistical experimental methods［J］.Process Biochemistry，2005，40(8):2757-2762.

［3］ San-Lang Wang，Hsin-Jen Chen，Tsu-Wen Liang，et al.A novel nattokinase produced by Pseudomonas sp.TKU015 using shrimp shells as substrate［J］.Process Biochemistry，2009，44(1):70-76.

［4］ 馬明，杜金華，王因，等.1株產(chǎn)納豆激酶菌株的分離篩選及鑒定［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(5):37-41.

［5］ Fujita M.，Nomura K.，Hong K.，et al.Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme(Nattokinase)in the vegetable Cheese Natto，a popular Soybean fermented food in Japan［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，1993，197(3):1340-1347.

［6］ Xin-mian H.，Run-fang G.，Hong-wei Y.，et al.Cloning and expression of one fibrinolytic enzyme from Bacillus sp.zlw-2［J］.Agricultural Sciences in China，2009，8(5):591-596.