馮輝，潘艷艷，李瑩，朱曉彤，曹雅明

(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽110001)

體內(nèi)建立適時(shí)適度的保護(hù)性免疫應(yīng)答有賴于免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的精確調(diào)控。大量研究表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)在宿主免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮舉足輕重的作用。Treg細(xì)胞是一群異質(zhì)性細(xì)胞，從來源分為胸腺來源的特征性表達(dá)Foxp3和組成性表達(dá)CD25的天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和在外周誘導(dǎo)產(chǎn)生的Tr1和Th3等。Foxp3因其是天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在胸腺內(nèi)發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)Treg發(fā)育及功能發(fā)揮起重要作用［1］。鼠瘧或流行區(qū)個(gè)體均已經(jīng)發(fā)現(xiàn)瘧疾感染會(huì)引起Treg數(shù)量變化。近期研究發(fā)現(xiàn)，利用靶向基因“knockin”法下調(diào)小鼠內(nèi)源性Foxp3基因表達(dá)導(dǎo)致Treg的抑制功能缺失［2］。流行區(qū)個(gè)體對(duì)瘧疾感染的抵抗性增強(qiáng)源于Treg功能性缺失［3］。對(duì)西非人群瘧疾易感性研究表明，F(xiàn)ulani人群表現(xiàn)為對(duì)瘧疾感染抵抗與體內(nèi)Treg功能相關(guān)基因Foxp3和CTLA-4低表達(dá)密切相關(guān)［3］。同時(shí)，利用惡性瘧原蟲感染紅細(xì)胞(iRBC)與正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)體外混合培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，iRBC能夠以劑量依賴性方式誘導(dǎo)CD4+CD25hiFoxp3hi細(xì)胞擴(kuò)增，并且對(duì)炎癥性細(xì)胞因子的分泌和保護(hù)性免疫應(yīng)答發(fā)揮免疫抑制作用［4］。由此，瘧疾感染Foxp3表達(dá)水平與Treg功能密切相關(guān)。本研究室曾利用不同鼠瘧模型研究顯示，小鼠對(duì)瘧原蟲的易感性與Treg活化密切相關(guān)［5-6］。目前，DBA/2小鼠對(duì)致死型夏氏瘧原蟲(Plasmodium chabadudi chabadui AS，P.c chabadui AS)呈現(xiàn)易感性的原因尚不明確。為深入探討Treg在瘧疾感染中的作用地位，研究P.c chabadui AS感染DBA/2小鼠Treg活化特點(diǎn)，探討Foxp3表達(dá)水平和Treg細(xì)胞功能與瘧疾易感性的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、瘧原蟲6～8周齡DBA/2小鼠，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;P.c chabaudi AS，日本愛媛大學(xué)分子寄生蟲學(xué)教研室惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑以下單克隆抗體(mAb)均購自美國BD Bioscience:抗-CD4-FITC mAb(GK 1.5)、抗-CD25-PE mAb(PC61)和FcγIII/II封閉抗體(2.4G2);抗-Foxp3-APC mAb(FJK-16S)和Foxp3胞內(nèi)染色試劑盒，購自美國eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染和Treg細(xì)胞消除模型制備

小鼠經(jīng)腹腔感染1×106P.c chabaudi AS寄生的紅細(xì)胞(pRBC)，小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，顯微鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率。小鼠在P.c chabaudi AS感染前1 d、感染后1 d和3 d間隔腹腔注射Anti-CD25mAb(7D4，IgM)1 mg/只/次，構(gòu)建Treg細(xì)胞消除鼠瘧模型。對(duì)照組在同一時(shí)間點(diǎn)注射等量PBS。

1.2.2 脾CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞流式染色無菌取出小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液，用0.17 mol/L NH4Cl裂解紅細(xì)胞。以含10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1×107/mL。取0.1 mL脾細(xì)胞懸液，預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體1 μg封閉30 min。設(shè)陰性對(duì)照管，抗-CD4-FITC、抗-CD25-PE和抗-Foxp3-APC單標(biāo)管。每份樣品同時(shí)用抗-CD4-FITC mAb和抗-CD25-PE mAb進(jìn)行細(xì)胞表面雙色標(biāo)記，4℃孵育

30 min。洗滌1次，棄上清。每管加0.25 mL Foxp3固定透膜劑，4℃孵育30 min。洗滌1次，棄上清。每管再加入抗-Foxp3-APC mAb進(jìn)行胞內(nèi)染色，4℃孵育30 min。洗滌1次，棄上清。用0.5 mL FBS/PBS重懸細(xì)胞，待流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.3 細(xì)胞獲取與分析利用流式細(xì)胞儀(FACAria II，美國B＆D公司)獲取細(xì)胞，使用前向散射角(FSC)及側(cè)向散射角(SSC)確定淋巴細(xì)胞群。以陰性對(duì)照為參考，將對(duì)照管所示的非特異熒光的99%以上作為本底扣除，以單標(biāo)管為對(duì)照，調(diào)整不同熒光通道補(bǔ)償。每個(gè)樣品獲取10 000～50 000個(gè)細(xì)胞。結(jié)果以二維點(diǎn)陣圖顯示。利用FAC expressV3 software分析流式結(jié)果。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，Student's t test比較分析組內(nèi)和組間均值的顯著性差異。P小于或等于0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 P.c chabaudi AS感染小鼠原蟲血癥和生存率

DBA/2對(duì)照組小鼠經(jīng)腹腔感染1×106P.c chabaudi AS寄生的紅細(xì)胞(pRBC)，于感染后5 d外周血可見瘧原蟲感染紅細(xì)胞，隨后紅細(xì)胞感染率迅速上升。在感染后5～7 d，紅細(xì)胞感染率從1%升至28%。在感染后8～9 d，紅細(xì)胞感染率達(dá)到峰值(40.3%)(圖1b)，小鼠于感染峰值后全部死亡(圖1a)。在Treg消除組，瘧原蟲感染的紅細(xì)胞在外周血中延遲出現(xiàn)(感染后6～7 d)，紅細(xì)胞感染率在原蟲血癥達(dá)峰值前(5～7 d)明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。原蟲血癥達(dá)峰值(37.5%)時(shí)間延遲至感染后10 d(圖1b)。隨后，紅細(xì)胞感染率陡然下降。在感染后10～15 d從35%降至3%，在感染后20 d瘧原蟲被清除，小鼠生存期明顯延長(圖1a)。

2.2 P.c chabaudi AS感染小鼠CD4+T細(xì)胞表面CD25和Foxp3表達(dá)水平

與未感染小鼠相比，對(duì)照組小鼠感染P.c chabaudi AS后Foxp3表達(dá)水平明顯增加。Foxp3平均熒光強(qiáng)度(MFI)顯示，F(xiàn)oxp3表達(dá)水平在感染后3d出現(xiàn)上升且維持增高水平，直到感染后10 d，小鼠出現(xiàn)死亡(P＜0.01，圖2)。與對(duì)照組相比，Treg消除組從感染后3 d，F(xiàn)oxp3表達(dá)出現(xiàn)降低，隨后有所回升。但在感染后5～8 d，F(xiàn)oxp3表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)，直到感染后10 d Foxp3表達(dá)水平回升至對(duì)照組水平(圖2b)。與Foxp3表達(dá)水平相比，Treg消除組CD25表達(dá)在感染后3 d出現(xiàn)一個(gè)短暫性明顯降低(P＜0.01)，隨后迅速恢復(fù)至對(duì)照組水平(圖2c)。

圖1 P.c chabaudi AS感染DBA/2小鼠CD25消除和對(duì)照組感染過程Fig.1 P.c chabaudi AS infection in DBA/2 control and CD25-depleted mice

圖2 P.c chabaudi AS感染中小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞表面CD25和Foxp3表達(dá)水平比較Fig.2 The expression levels of Foxp3+on CD25+from CD4+T cells from DBA/2 control and CD25-depleted mice infected with P.c chabaudi AS

2.3 P.c chabaudi AS感染小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量

鑒于P.c chabaudi AS感染后，對(duì)照組小鼠脾臟Foxp3表達(dá)出現(xiàn)明顯增加。根據(jù)Foxp3表達(dá)的熒光強(qiáng)度，將高表達(dá)Foxp3的Treg細(xì)胞單獨(dú)劃分為CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞(圖3a)。與未感染小鼠相比，在感染后3 d，對(duì)照組CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞百分含量和絕對(duì)值數(shù)量均明顯增加(P＜0.01，圖3d)，在瘧血癥峰值時(shí)CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞絕對(duì)值達(dá)到峰值。CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞的百分含量和絕對(duì)值與CD4+CD25+Foxp3+具有相似的變化趨勢。然而，CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞總數(shù)比CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞增加幅度明顯(圖3b、c、d、e)。與對(duì)照組相比，在感染后3～8 d，Treg消除組CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞總數(shù)明顯降低(P＜0.01，圖3b、c)，在感染后10 d出現(xiàn)回升。在感染后3 d，Treg消除組脾臟CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞總數(shù)是對(duì)照組的30%，隨著對(duì)照組CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞總數(shù)的增加，Treg消除組CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞所占比例進(jìn)一步降低。在對(duì)照組CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞總數(shù)達(dá)峰值時(shí)，Treg消除組CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞總數(shù)是對(duì)照組的15%。

圖3 P.c chabaudi AS感染中小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞數(shù)量比較Fig.3 The percentage and absolute number of splenic CD4+CD25+Foxp3+cells from DBA/2 control and CD25-depleted mice infected with P.c chabaudi AS infection

3 討論

本研究結(jié)果顯示，DBA/2小鼠對(duì)P.c chabaudi AS感染易感，在原蟲血癥達(dá)峰值后小鼠相繼死亡。在感染過程中，DBA/2小鼠CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞數(shù)量明顯增加，且以CD4+CD25+Foxp3hi增加更為明顯。伴隨著瘧血癥峰值出現(xiàn)CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞數(shù)量亦達(dá)到峰值。相比，Treg消除鼠的原蟲出現(xiàn)時(shí)間和瘧血癥峰值時(shí)間均明顯延遲，且在瘧血癥達(dá)峰值前(5～8 d)原蟲血癥水平明顯低于對(duì)照組。與之相應(yīng)，CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞數(shù)量明顯處于低水平。同時(shí)，Treg消除鼠生存期明顯延長。由此提示，P.c chabaudi AS感染導(dǎo)致Foxp3表達(dá)增加，擴(kuò)增的CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞有利于瘧原蟲復(fù)制和逃避宿主免疫應(yīng)答，進(jìn)而影響瘧疾感染的進(jìn)程和最終結(jié)局。

惡性瘧患者體內(nèi)Treg的活化與瘧原蟲高水平增殖密切相關(guān)［7］。同時(shí)，間日瘧原蟲感染中Treg活化數(shù)量增高與原蟲負(fù)荷增加有關(guān)［8］。但同時(shí)有研究證實(shí)Treg不能對(duì)瘧疾急性期感染發(fā)揮調(diào)控作用［9］。Hiseada等多個(gè)研究小組［10-14］證實(shí)Treg能夠輔助原蟲逃避宿主免疫監(jiān)視，Treg可能是宿主對(duì)原蟲發(fā)生免疫耐受的主要原因。但近期有研究顯示，消除Treg將導(dǎo)致宿主貧血、原蟲負(fù)荷增加和病理性炎癥應(yīng)答等不良癥狀出現(xiàn)［15］。由此可見，瘧疾感染中Treg對(duì)宿主發(fā)揮免疫調(diào)控作用的利弊效應(yīng)仍存在爭議。

在小鼠模型中，經(jīng)典消除Treg的方法是利用IgM anti-CD25 antibody 7D4［10］或IgG1 anti-CD25 antibody PC61［8］消除CD25+細(xì)胞，最終降低CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞數(shù)量。2種方法具有各自的優(yōu)勢，7D4mAb消除Treg細(xì)胞速度快但維持時(shí)間短，而PC61mAb發(fā)揮作用慢維持時(shí)間長。本研究利用7D4mAb作用快速的特點(diǎn)來達(dá)到短期消除CD25+細(xì)胞的效果。結(jié)果顯示，7D4mAb對(duì)Foxp3高表達(dá)的影響非常明顯，能夠顯著降低CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞數(shù)量。CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞的免疫抑制功能可能更為顯著。

綜上，P.c chabaudi AS感染導(dǎo)致CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞數(shù)量與原蟲復(fù)制密切相關(guān)。CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞可能輔助原蟲逃避宿主免疫應(yīng)答，進(jìn)而影響瘧疾感染的進(jìn)程和最終結(jié)局。因此，充分認(rèn)識(shí)CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞的免疫調(diào)控機(jī)理，對(duì)研制和開發(fā)有效的瘧疾疫苗和抗瘧新藥將具有重要的科學(xué)意義。

［1］ Fontenot JD，Gavin MA，Rudensky AY.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells［J］.Nat Immunol，2003，4(4):330-336.

［2］ Wan YY，F(xiàn)lavell RA.Regulatory T-cell functions are subverted and converted owing to attenuated Foxp3 expression［J］.Nature，2007，445(7129):766-770.

［3］ Torcia MG，Santarlasci V，Cosmi L，et al.Functional deficit of T regulatory cells in Fulani，an ethnic group with low susceptibility to Plasmodium falciparum malaria［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(2):646-651.

［4］ Scholzen A，Mittag D，Rogerson SJ，et al.Plasmodium falciparum-mediated induction of human CD25Foxp3 CD4 T cells is independent of direct TCR stimulation and requires IL-2，IL-10 and TGFbeta［J］.PLoS Pathog，2009，5(8):e1000543.

［5］ Zheng W，Wang QH，F(xiàn)eng H，et al.CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells prevent the development of Th1 immune response by inhibition of dendritic cell function during the early stage of Plasmodium yoelii infection in susceptible BALB/c mice［J］.Folia Parasitol(Praha)，2009，56(4):242-250.

［6］ Chen G，Liu J，Wang QH，et al.Effects of CD4(+)CD25(+)Foxp3(+)regulatory T cells on early Plasmodium yoelii 17XL infection in BALB/c mice［J］.Parasitology，2009，136(10):1107-1120.

［7］ Walther M，Tongren JE，Andrews L，et al.Upregulation of TGF-beta，F(xiàn)OXP3，and CD4+CD25+regulatory T cells correlates with more rapid parasite growth in human malaria infection［J］.Immunity，2005，23(3):287-296.

［8］ Bueno LL，Morais CG，Araujo FF，et al.Plasmodium vivax:induction of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells during infection are directly associated with level of circulating parasites［J］.PLoS One，5(3):e9623.

［9］ Walther M，Jeffries D，F(xiàn)inney OC，et al.Distinct roles for FOXP3 and FOXP3 CD4 T cells in regulating cellular immunity to uncomplicated and severe Plasmodium falciparum malaria［J］.PLoS Pathog，2009，5(4):e1000364.

［10］ Hisaeda H，Maekawa Y，Iwakawa D，et al.Escape of malaria parasites from host immunity requires CD4+CD25+regulatory T cells［J］.Nat Med，2004，10(1):29-30.

［11］ Long TT，Nakazawa S，Onizuka S，et al.Influence of CD4+CD25+T cells on Plasmodium berghei NK65 infection in BALB/c mice［J］.Int J Parasitol，2003，33(2):175-183.

［12］ Nie CQ，Bernard NJ，Schofield L，et al.CD4+CD25+regulatory T cells suppress CD4+T-cell function and inhibit the development of Plasmodium berghei-specific TH1 responses involved in cerebral malaria pathogenesis［J］.Infect Immun，2007，75(5):2275-2282.

［13］ Tetsutani K，Ishiwata K，Ishida H，et al.Concurrent infection with Heligmosomoides polygyrus suppresses anti-Plasmodium yoelii protection partially by induction of CD4(+)CD25(+)Foxp3(+)Treg in mice［J］.Eur J Immunol，2009，39(10):2822-2830.

［14］ Wu Y，Wang QH，Zheng L，et al.Plasmodium yoelii:distinct CD4(+)CD25(+)regulatory T cell responses during the early stages of infection in susceptible and resistant mice［J］.Exp Parasitol，2007，115(3):301-304.

［15］ Cambos M，Belanger B，Jacques A，et al.Natural regulatory(CD4+CD25+FOXP+)T cells control the production of proinflammatory cytokines during Plasmodium chabaudi adami infection and do not contribute to immune evasion［J］.Int J Parasitol，2008，38(2):229-238.