孫佑赫，周開(kāi)艷，熊智

(西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明650224)

昆蟲(chóng)腸道內(nèi)寄居著大量的細(xì)菌，正常的腸道細(xì)菌是昆蟲(chóng)寄主生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖所必須的。近年來(lái)隨著胃腸道微生態(tài)理論研究的逐步深入，對(duì)昆蟲(chóng)腸道菌群結(jié)構(gòu)和產(chǎn)酶菌株的研究，已成為新的研究熱點(diǎn)。目前，對(duì)白蟻、家蠶［1-3］等腸道菌群的研究報(bào)道較多，同時(shí)亦發(fā)現(xiàn)各類(lèi)產(chǎn)酶菌株的存在，并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究［4-5］。脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)是一類(lèi)在油水界面催化天然底物油脂(甘油三脂)降解為甘油和游離脂肪酸的酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中［6］。微生物脂肪酶比動(dòng)植物脂肪酶作用的溫度和pH范圍寬，易獲得較高純度酶制劑，適合于工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)［7］。以往，研究者多從土壤、淤泥中采集樣品篩選產(chǎn)酶微生物，本實(shí)驗(yàn)以思茅地區(qū)嚴(yán)重危害各類(lèi)松樹(shù)的思茅松毛蟲(chóng)為實(shí)驗(yàn)材料，分離其腸道內(nèi)產(chǎn)脂肪酶菌株。通過(guò)純培養(yǎng)和16S rDNA序列分析，對(duì)產(chǎn)酶菌株進(jìn)行初步鑒定和酶學(xué)性質(zhì)研究，為開(kāi)發(fā)新的具有應(yīng)用價(jià)值的資源微生物增加新的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基①分離培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂18，pH 7.0～7.2;②脂肪酶篩選培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5，蛋白胨10，橄欖油10，瓊脂15，pH 7.0～7.2;③種子培養(yǎng)基(g/L):同分離培養(yǎng)基，不加瓊脂;④產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基［8-9］(g/L):牛肉膏5，蛋白胨5，橄欖油10，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，(NH4)2SO41，pH 7.0～7.2。

1.1.2 主要試劑和儀器DNA提取試劑盒(天根公司)、2×Power Taq PCR MasterMix(BIOTEKE公司)、通用引物(TaKaRa公司)，其余試劑均為分析純;PCR儀(Biometra公司，TGRADIENT)，高速離心機(jī)(Eppendorf公司)、凝膠成像分析儀(Bio-Rad公司，Gel-Doc XR+);電泳儀、滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、搖床、培養(yǎng)箱、紫外分光光度計(jì)等均為國(guó)產(chǎn)儀器。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離篩選采自云南普洱的思茅松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)，無(wú)菌水飼養(yǎng)24 h，排盡其腸道殘余食物。無(wú)菌條件下解剖蟲(chóng)體取其腸道，研磨后，梯度稀釋法涂布于分離培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h。挑取表征形態(tài)各異的單菌落劃線純化，鏡檢至純菌株后，使用點(diǎn)接法接種到篩選培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h。然后觀察記錄篩選培養(yǎng)基中能產(chǎn)生透明圈的菌株。將初篩菌株接種于種子培養(yǎng)基，37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜。種子液以2%的接種量接種于產(chǎn)酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗酶液測(cè)酶活。

1.2.2 酶活力測(cè)定及酶學(xué)性質(zhì)研究采用經(jīng)典的聚乙烯醇橄欖油乳化液法［10-11］測(cè)酶活，每分鐘催化脂肪水解產(chǎn)生1 μmol脂肪酸所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U/mL)。相對(duì)酶活力是指實(shí)驗(yàn)中所測(cè)得的酶活力值與最高酶活力值的百分比。酶的最適溫度:分別測(cè)定不同反應(yīng)溫度下(25、30、35、40、45、50℃)酶活力，確定最適溫度。酶的最適pH:PBS緩沖液調(diào)節(jié)底物pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在最適溫度下測(cè)酶活力，以確定最適pH值。

1.2.3 產(chǎn)酶菌株的分子生物學(xué)鑒定細(xì)菌DNA試劑盒提取產(chǎn)酶菌株基因組DNA，作為反應(yīng)模板進(jìn)行PCR基因擴(kuò)增。體系:2×Power Taq PCR MasterMix 25 μL，通用引物(正向引物27f:5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，反向引物1492r:5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3')各2 μL，DNA模板1 μL，無(wú)菌水補(bǔ)足50 μL;條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，56℃復(fù)性1 min，72℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán);72℃最終延伸5 min。取50 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送華大基因公司測(cè)序。得到測(cè)序結(jié)果后登陸NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析［12］，尋找最相似的已知分類(lèi)地位的序列。使用MEGA4.1軟件的Neighbor-Joining法［13］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(bootstrap重復(fù)次數(shù)為1 000)，以確定菌株的分類(lèi)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

從思茅松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)腸道內(nèi)篩選出7株產(chǎn)脂肪酶菌株(D2、D7、D9、D12、D16、D17、D19)，部分水解透明圈如圖1所示。

圖1 產(chǎn)脂肪酶菌株在篩選培養(yǎng)基上形成的透明圈Fig.1 Transparent hydrolysis circle by lipase-producing strains

2.2 產(chǎn)酶菌株酶學(xué)性質(zhì)分析

2.2.1 酶最適作用溫度各產(chǎn)酶菌株在不同的反應(yīng)溫度下測(cè)得的酶活力值如圖2所示:這7株產(chǎn)酶菌所產(chǎn)脂肪酶的最適溫度在30～40℃之間。D9、D16的最適溫度是30℃，D7、D17的最適溫度是35℃，D2、D12、D19的最適溫度為40℃。其中D9和D16酶促反應(yīng)的熱穩(wěn)定性稍差，在最適溫度附近變化幅度大，相對(duì)酶活力達(dá)60%左右。

圖2 溫度對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of lipase

2.2.2 酶最適作用pH在最適溫度和不同pH條件下各產(chǎn)酶菌株的酶活力如圖3所示:產(chǎn)酶菌株的最適pH集中在8.0～9.0之間，為堿性脂肪酶，在pH 8.0～10.0的范圍內(nèi)相對(duì)酶活力都比較高，達(dá)到80%以上，說(shuō)明pH穩(wěn)定性都比較好。

圖3 pH對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of lipase

2.3 產(chǎn)酶菌株的鑒定結(jié)果

提取產(chǎn)酶菌株的基因組DNA并進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，通過(guò)BLAST比對(duì)分析，選取同源性在98%以上的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)。由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知7株產(chǎn)酶菌株分屬3個(gè)屬:D2、D12、D19屬于假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)，D7、D17屬于芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)，D9、D16屬于克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)。

圖4 產(chǎn)酶菌株的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree derived from 16S rDNA gene sequence of lipase-producing strains

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從思茅松毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)腸道內(nèi)分離篩選出7株產(chǎn)脂肪酶的菌株，經(jīng)過(guò)對(duì)所產(chǎn)脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)的初步研究，確定這些酶作用的最適溫度是30～40℃，最適pH是8.0～9.0，屬于中溫堿性脂肪酶，這與鱗翅目昆蟲(chóng)堿性(pH 8.0～10.0)腸道環(huán)境相關(guān)聯(lián)。通過(guò)研究產(chǎn)酶菌株的產(chǎn)酶溫度和pH，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶菌株的酶活力與已報(bào)道的高產(chǎn)酶菌株酶活力［14］還有一定的差距，有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究，優(yōu)化產(chǎn)酶條件或誘變育種等手段，提高產(chǎn)酶能力和酶活性。

對(duì)產(chǎn)酶菌株的16S rDNA基因序列測(cè)定和比對(duì)后，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，初步將這7株產(chǎn)酶菌株歸屬為假單胞菌屬、芽胞桿菌屬和克雷伯氏菌。這些種屬細(xì)菌在天牛、家蠶、白蟻、蝗蟲(chóng)［15］等昆蟲(chóng)的腸道菌群中都有存在，此外常見(jiàn)的昆蟲(chóng)腸道細(xì)菌還有葡萄球菌屬、鏈球菌屬、微球菌屬、腸桿菌屬、乳桿菌屬、變形桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、氣單胞菌屬、埃希氏菌屬、沙雷氏菌屬等。

目前發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)脂肪酶和用于工業(yè)生產(chǎn)的細(xì)菌有28個(gè)屬，主要有伯克霍爾德氏菌、無(wú)色桿菌屬、芽胞桿菌屬、色桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、節(jié)桿菌屬和假單胞菌屬［16］。本實(shí)驗(yàn)篩選出的產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌除包括2種常見(jiàn)的菌屬外，還有一種克雷伯氏菌，從該屬中分離到產(chǎn)脂肪酶菌株的研究很少見(jiàn)報(bào)道［17］。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)克雷伯氏菌產(chǎn)脂肪酶性質(zhì)在開(kāi)發(fā)新穎的資源微生物方面具有積極的研究意義。

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