張蓓蓓 劉曉 湛先保 李兆申

·綜述與講座·

急性胰腺炎細胞的死亡方式

張蓓蓓 劉曉 湛先保 李兆申

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)腺泡細胞有3種死亡形式，即凋亡、自噬及壞死。凋亡有依賴半胱氨酸-天冬氨酸-特異性蛋白酶(Caspase)和非依賴Capase兩種信號通路，其中以前者為主。依賴Caspase通路即通過線粒體外膜滲透作用和(或)細胞表面死亡受體通路激活Capase誘導腺泡形成凋亡小體并被吞噬細胞吞噬。非依賴Caspase通路則可能是通過溶酶體蛋白(如組織蛋白酶D，CatD)的活化而導致細胞死亡[1]。自噬是非依賴于吞噬細胞的自我降解過程，大量胞質(zhì)及細胞器包被于多層膜結(jié)構(gòu)的自噬空泡(自體吞噬體)中，隨后被溶酶體系統(tǒng)降解(自噬溶酶體)。凋亡及自噬均被認為是程序性細胞死亡，對AP的影響尚不明確。壞死伴有細胞成分外溢，可引發(fā)炎癥反應，對機體造成嚴重損傷。最近對壞死是否受控也開始有不同的觀點[2]。探討3種細胞死亡類型和相互關(guān)系，以及對AP的影響有助于加深我們對AP病理生理過程的理解。

一、細胞凋亡

凋亡，即I型程序性細胞死亡，是細胞自我破壞從而維持穩(wěn)態(tài)的生理過程，也稱為細胞自殺。凋亡具有不同的形態(tài)學及生化特征，包括胞質(zhì)皺縮、細胞器受損、細胞膜生出泡狀結(jié)構(gòu)、核裂解、DNA片段裂解、磷脂酰絲氨酸暴露、凋亡小體包被裂解片段、巨噬細胞或其他吞噬細胞處理裂解細胞碎片等。整個過程不會引起炎癥反應[3]。凋亡失調(diào)能引起嚴重的后果，如癌癥、神經(jīng)退行性變和自身免疫疾患等[3]。在糖尿病、慢性胰腺炎、胰腺癌等胰腺疾病中凋亡都發(fā)揮了重要的作用[3]。

凋亡由細胞表面死亡受體途徑或線粒體途徑所誘導[3]。Caspase作為凋亡通路的核心有以下幾個特征：(1)半胱氨酸殘基作為催化部位活化；(2)底物天冬氨酸殘基特異性裂解；(3)非活性酶原合成。Caspase底物包括：凋亡和炎癥調(diào)節(jié)因子、蛋白激酶和其他信號轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)因子、細胞質(zhì)和細胞核結(jié)構(gòu)蛋白、修復酶和管家酶及細胞周期調(diào)節(jié)因子等。目前已知的凋亡途徑有兩條：(1)外源性通路，由細胞表面受體(如FAS介導的Caspase 8或Caspase10)啟動及隨后Caspase 3活化而觸發(fā)；(2)內(nèi)源性通路，如細胞毒性T細胞使線粒體外膜滲漏，造成細胞色素C(cytochromeC，CytC)的釋放并活化下游效應Capases。凋亡是主動的耗能過程，線粒體一旦不能提供足夠的ATP，凋亡就會受到抑制而啟動壞死。凋亡可由多種刺激誘發(fā)，研究發(fā)現(xiàn)Caspase通路中凋亡X-連接抑制劑(X-linked inhibitor of apoptosis，XIAP)和受體間蛋白(receptor-interacting protein，RIP)在AP細胞死亡的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。大鼠雨蛙素誘導的急性水腫性胰腺炎(AEP)模型中，Caspase迅速活化，XIAP活性下降，而急性壞死性胰腺炎(ANP)模型中，Caspase被阻斷，XIAP未降解，提示XIAP通過抑制凋亡加重了AP。凋亡起到保護作用，而壞死加劇了病理過程。因此，ANP時壞死多，凋亡少，而AEP時則反之[4]。

對于外源性通路，Caspase 8由死亡結(jié)構(gòu)域受體與Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(FADD)相互作用被激發(fā)而最先啟動。Caspase 8的自動催化活化和死亡誘導信號復合物(DISC)寡聚體是細胞死亡啟動的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。Caspase 10和Caspase 2也參與其中，但作用仍不清楚[3]。Caspase 8活化后有兩條路徑：I型通路中Caspase 3和Caspase 7加工和活化，通過裂解不同的底物，包括其他的Caspase擴大級聯(lián)反應。Ⅱ型通路中Caspase 8裂解胞質(zhì)促凋亡Bcl-2家族成員Bid并向線粒體轉(zhuǎn)移，導致促凋亡Bcl-2家族成員Bax和Bak寡聚化后CytC被釋放并誘導凋亡小體形成，其后途徑與內(nèi)源性相似[5-7]。

內(nèi)源性通路中，Ca2+依賴性的線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放是CytC釋放到胞質(zhì)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。CytC一旦被釋放，凋亡肽酶激活因子1和促Caspase 9因子形成凋亡體，激活Caspase 9、Caspase 3，裂解特異凋亡靶目標引起細胞死亡。最近有證據(jù)顯示缺少腺苷酸轉(zhuǎn)運蛋白(adenine nucleotide translocator ，ANT)的亞型使MPTP在誘導凋亡中的作用受到質(zhì)疑。環(huán)孢素D基因缺失的鼠模型不能形成環(huán)孢素A依賴的MPTP，但仍能受到不同凋亡信號的刺激而死亡[8]。

Ca2+信號的過度增高被認為是啟動AP的核心[9]。目前研究認為，Ca2+濃度的振蕩引發(fā)凋亡[10]，而持續(xù)的升高引發(fā)壞死[11]。生理條件下，受刺激的細胞內(nèi)局部Ca2+濃度增加產(chǎn)生NADPH，隨后該中介物燃燒ATP，使分泌減少。而細胞整體持續(xù)的Ca2+濃度增加使ATP濃度劇烈下降。Ca2+受到第二信使包括三磷酸肌醇(IP3)、煙酸腺嘌呤二核苷酸(NAADP)、環(huán)腺苷二磷酸核糖(cADPR)的精確調(diào)控，使分泌局限在腺泡細胞的頂膜側(cè)，線粒體周圍的緩沖系統(tǒng)限制Ca2+信號擴散到基底膜，高爾基體也可能參與其中。利用抑制劑或基因敲除動物的AP模型已證明磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)通過抑制肌漿網(wǎng)Ca2+ATP酶介導了Ca2+濃度的持續(xù)上升。利用Ca2+螯合劑(BAPTA)阻斷Ca2+升高即可阻止CCK的強刺激、膽汁酸及乙醇誘導的胰腺腺泡細胞的酶原激活。

二、自噬

自噬至少有3種形式：(1)大分子吞噬作用；(2)分子蛋白介導的自噬；(3)小細胞自噬。自噬通常指的是大分子吞噬作用，是細胞為適應環(huán)境的自我保護現(xiàn)象[12]，可維持細胞功能的穩(wěn)態(tài)，如蛋白和細胞器的更新。當細胞需要更多的能量時自噬會迅速上調(diào)。生理條件下饑餓可誘發(fā)自噬。目前研究酵母基因中發(fā)現(xiàn)超過20種自噬相關(guān)基因(ATG)參與自體吞噬體的形成。自噬降解長壽命蛋白和細胞器，為細胞再循環(huán)提供所需材料。酵母菌自噬基因缺失的突變株在無氮源的饑餓條件下不能存活即是一個例證。待降解的細胞器先被自體吞噬體包被(雙層膜的囊泡)，再與次級內(nèi)體(endosome)融合，最終與溶酶體融合成自噬溶酶體[13]。融合步驟依賴于溶酶體相關(guān)膜蛋白(Lamp-2)介導。自噬溶酶體中起降解作用的主要是組織蛋白酶家族(Cat)。Cat通過一系列的溶蛋白酶裂解過程被激活。首先其被加工為單鏈形式，再裂解為重鏈和輕鏈并形成非共價復合物(雙鏈形式)，這標志著酶的成熟。成熟的Cat通常出現(xiàn)在溶酶體中，一部分也可存在于溶酶體前體。不同AP模型(精氨酸或雨蛙素)中觀察到Cat L單鏈或雙鏈堆積，Cat B數(shù)量下降。Cat L的作用是降解胰蛋白酶原或胰蛋白酶，而Cat B激活胰蛋白酶原。由此推測Cat L和Cat B的失衡導致了腺泡細胞早期事件的發(fā)生。利用Cat非特異抑制劑亮肽素(leupeptin)可引起腺泡細胞大的自噬空泡的堆積[14]，提示Cat在胰蛋白酶原激活和空泡形成中均有重要作用。

自噬又可分為選擇性與非選擇性兩種形式。饑餓等應激誘發(fā)的是非選擇性自噬[12]。當胞內(nèi)存在高能量信號如氨基酸及胰島素信號時可活化mTOR(一種促進蛋白合成的激酶)而抑制自噬。當mTOR活化減少時自噬上調(diào)以應對營養(yǎng)剝奪。而缺氧時線粒體選擇性自噬(mitophagy)及非選擇性自噬均存在。

自噬在AP中的作用尚未明確，其爭議在于激活自噬的意義是加速細胞能量營養(yǎng)補充從而有益于細胞存活或及時提供ATP使細胞應激時啟動凋亡以減輕損傷，還是使胰蛋白酶原激活而直接損傷腺泡。Atg 5是一種重要的自噬誘導蛋白，一項關(guān)于敲除Atg 5基因的小鼠模型的研究提出過度自噬可能誘發(fā)腺泡細胞胰蛋白酶原的激活[15]?；蚯贸驝CK誘導的AP炎癥程度減輕，提示自噬的破壞作用。利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)建立AP模型發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶原活化受阻。另一項實驗[12]將AP模型和饑餓模型比較，發(fā)現(xiàn)兩者都存在自噬現(xiàn)象，但AP模型溶酶體降解受抑，自噬延緩。自噬溶酶體降解能力的下降是由于溶酶體中的水解酶活力下降。在該研究中還證實空泡的堆積與自噬受抑相關(guān)。AP模型中的空泡在數(shù)量和體積上都較饑餓模型增大，推測空泡可能是自噬激活或自噬紊亂造成的結(jié)果。雷帕霉素(rapamycin)通過抑制阻斷自噬起始階段的激酶mTOR誘導自噬沒有使胰酶活化的基礎水平提高，這一現(xiàn)象說明自噬活化本身不能誘導胰蛋白酶的激活。利用免疫組化觀察AP胰蛋白酶原激活的部位，發(fā)現(xiàn)自噬標記物LC3-Ⅱ和溶酶體標記物LAMP-2部分共定位于胰蛋白酶原激活肽TAP部位，這表明自噬空泡形成一個獨立的區(qū)域，是胰蛋白酶原活化的部位[12]。

三、壞死

壞死是一種無凋亡和自噬特征的死亡方式，通常認為不受調(diào)控。但最近研究發(fā)現(xiàn)壞死的發(fā)生過程也可能受到嚴密調(diào)控。在損傷信號作用下，腺泡細胞線粒體功能下降、活性氧產(chǎn)生增強、ATP消耗、蛋白水解酶或組織蛋白酶分解蛋白和早期質(zhì)膜破裂等壞死的過程均受到調(diào)控。因此，壞死也可定義為程序性細胞死亡。其依據(jù)包括：首先，涉及軟骨細胞(chrondrocytes)死亡的骨生長長度的控制、小腸上皮細胞保持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)等均有壞死參與；其次，壞死由特殊質(zhì)膜受體與生理配體觸發(fā)，提示存在特殊信號通路介導壞死；第三，壞死信號易感性可受先天及后天因素調(diào)節(jié)，例如不同品系鼠對腦缺血的敏感性不同，不同年齡和大腦不同區(qū)域的敏感性也不同；第四，抑制一些酶能阻斷壞死，提示這些酶在死亡進程中扮演確定的推助作用；第五，Caspase能改變細胞死亡形式從Ⅰ型凋亡到Ⅱ型自噬或到Ⅲ型壞死。在觀察鼠胚胎腎永生細胞(IBMK細胞)時發(fā)現(xiàn)，抑制基因敲除促凋亡蛋白Bax和Bak或過表達抗凋亡蛋白Bcl-2，同時抑制線粒體膜滲透性作用能引起凋亡向自噬的轉(zhuǎn)變。而轉(zhuǎn)染組成功活化Akt蛋白激酶或基因敲除編碼促自噬Beclin-1蛋白的等位基因可抑制自噬，使自噬向壞死轉(zhuǎn)變[16]。小鼠胚胎成纖維細胞受依托泊苷刺激時，敲除Bax和Bak基因同時缺少自噬蛋白如Atg 5可導致細胞壞死延遲[17]。壞死可能是特殊信號轉(zhuǎn)導的級聯(lián)反應，也可能是凋亡受抑的表現(xiàn)，并推測凋亡和自噬都是在壞死基礎上進化衍生出來的。在細胞急性死亡模型中，PARP、RIP1、CypD、calpains及Cat受抑可抑制壞死。在AP模型中采用恩貝酸阻斷XIAP促進凋亡，可減輕壞死和炎癥，此與Caspase介導的RIP1裂解相關(guān)[18]。

四、AP時自噬、凋亡、壞死之間的關(guān)系

目前有實驗證實凋亡基因缺失模型中自噬阻止了壞死的發(fā)生。一項研究[19]采用乙醇和內(nèi)毒素聯(lián)合建立AP模型后通過檢測發(fā)現(xiàn)Lamp-2(參與自體吞噬體與溶酶體融合)和Gramp-92(顆粒相關(guān)蛋白)等幾種溶酶體膜蛋白的消失，并觀察到自體吞噬體的堆積和自噬溶酶體的缺乏，降低了ATP水平，導致凋亡向壞死的轉(zhuǎn)變。該研究認為內(nèi)毒素誘導的AP中自噬后期進程受到抑制，導致胰腺腺泡的空泡形成。此模型進一步證實溶酶體膜蛋白在自噬形成過程中的關(guān)鍵作用。然而此研究并沒有闡明凋亡和自噬在AP中的聯(lián)系。凋亡和自噬是協(xié)同、疊加還是拮抗，以及各自導向壞死的通路尚待探討。

自噬對凋亡促進或抑制取決于外界條件[20]。PUMA(p53-inducible BH3-only protein)或Bax誘導的線粒體選擇性靶點自噬能促進凋亡[21]，而乳腺癌細胞DNA受損使自噬延緩其凋亡過程[22]。最近熱休克線粒體變化的研究[19]探討了自噬與凋亡的關(guān)系。自噬是線粒體受損后被清除的通路，熱休克后線粒體去極化啟動選擇性自噬也稱Mitophagy。Mitophagy通過減少CytC的釋放和下游Caspase的活化使熱休克誘導的凋亡被阻斷，這證明了自噬對凋亡的抑制作用及對細胞的保護角色。Bcl-2家族在自噬的調(diào)節(jié)方面扮演雙重角色?？沟蛲龅鞍兹鏐cl-2、Bcl-XL、Bcl-w和Mcl-1抑制自噬，而促凋亡蛋白BNIP3、Bad、Bik、Noxa、Puma和BimEL能誘導自噬[23]。然而不同模型中自噬及凋亡的意義并不相同。在一項研究中專門對比了雨蛙素及精氨酸誘導的AP模型中凋亡蛋白及自噬蛋白的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)促凋亡基因Bax、Bcl-1及凋亡相關(guān)蛋白Capn-2、5在雨蛙素模型中明顯高于精氨酸組，抗凋亡蛋白Bcl-2則較精氨酸組明顯減少。微管相關(guān)蛋白1輕鏈Map1lc3a(自噬標記蛋白)在雨蛙素組也高于精氨酸組[25]。這說明雨蛙素模型易于引發(fā)凋亡和自噬。在一項乙醇聯(lián)合脂多糖LPS誘導的AP模型中觀察到，乙醇聯(lián)合LPS與LPS單純注射相比，抑制了Caspase 3、Caspase 9的活化，即抑制了凋亡，同時檢測到LC3-Ⅱ增加。微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC3-Ⅰ)通常存在于胞質(zhì)中，自噬時通過palmitoylate(棕櫚?；?形成膜結(jié)合LC3-Ⅱ并與自體吞噬體相關(guān)，意味著自體吞噬體的堆積，即向自體溶酶體的轉(zhuǎn)化受到干擾。這說明LPS聯(lián)合乙醇模型中凋亡和自噬同時受到抑制[25]。

綜上所述，AP腺泡細胞受到各種打擊，通過不同通路產(chǎn)生相應效應，最終導致細胞死亡。不同的死亡方式對機體預后影響差別很大。在不能避免病因打擊的情況下，采取哪些方法誘導腺泡細胞減少炎癥反應是應努力解決的難題。凋亡、自噬及壞死被認為是AP中的3種細胞死亡形式，壞死目前被認為是炎癥的啟動者，而凋亡和自噬對腺泡有保護作用。鑒于三者間的關(guān)系錯綜復雜，闡明并調(diào)節(jié)細胞死亡信號向凋亡和自噬轉(zhuǎn)變是探索新的AP防治手段的方向。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.026

上海市自然科學基金課題資助(18ZR1447600)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院消化內(nèi)科

李兆申，Email：zhsli@81890.net

2011-05-23)

(本文編輯：屠振興)