馬麗紅 綜述，唐彤宇審校

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院 胃腸內(nèi)科，吉林 長春130021）

結(jié)直腸癌（CRC）是一種基因病，是常見的消化道惡性腫瘤。歐洲CRC發(fā)病率及死亡率居惡性腫瘤的第二位［1］。我國CRC發(fā)病率呈逐漸上升趨勢［2］。由于飲食和生活習(xí)慣變化2007年全世界新增120萬CRC病例中有60萬人［3］死亡。目前常用診斷方法如糞便隱血試驗(yàn)（fecal occult blood test，F(xiàn)OBT）、結(jié)直腸鏡檢查、影像學(xué)檢查等存在不足，甚至可導(dǎo)致腸道出血、穿孔、感染等并發(fā)癥，限制了它們在CRC早期診斷中的應(yīng)用，一旦確診CRC多數(shù)已為進(jìn)展期。近年來，表觀遺傳學(xué)機(jī)制受到人們的關(guān)注，并發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中DNA序列外的調(diào)控機(jī)制異常非常普遍［4］，因此DNA甲基化與腫瘤的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)。DNA異常甲基化作為腫瘤發(fā)生發(fā)展中的早期事件［5］，使其成為診斷治療腫瘤的標(biāo)志物。本文就特定基因甲基化在早期診斷CRC中的應(yīng)用綜述如下。

1 表觀遺傳學(xué)與DNA甲基化

表觀遺傳學(xué)是研究非基因核苷酸序列改變所導(dǎo)致的基因表達(dá)變化如DNA甲基化、組蛋白乙?；⑷旧w重塑等［6］。研究結(jié)果表明，表觀遺傳學(xué)異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，特別是基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化導(dǎo)致的抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活，影響著腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段［7］。

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA Methyltransferase，DNMT）的作用下，DNA的CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性的添加甲基形成5－甲基胞嘧啶的化學(xué)修飾過程［8］，DNA的不同甲基化狀態(tài)（超甲基化與去甲基化）與基因的活性和功能有關(guān)。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶有兩種，持續(xù)性甲基化轉(zhuǎn)移酶如DNMT1和另一種是重新甲基化轉(zhuǎn)移酶如DNMT3a和DNMT3b，它們可以使去甲基化的CpG位點(diǎn)重新甲基化。甲基化位點(diǎn)可隨DNA的復(fù)制而遺傳給后代細(xì)胞［9，10］。DNA甲基化是發(fā)生在DNA復(fù)制之后的基因外修飾，不改變DNA的堿基序列，而是通過影響DNA的表達(dá)而改變其功能。在人類基因組中，Cp G常成簇存在，Cp G島是堿基CG出現(xiàn)頻率較高的區(qū)域，其常位于DNA的5’端啟動(dòng)子區(qū)，并且人類基因啟動(dòng)子60%以上包含在Cp G島內(nèi)?；騿?dòng)子區(qū)CpG島異常甲基化導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄失活，并通過有絲分裂傳遞這種后生性改變［11］。生理情況下，Cp G島多呈非甲基化狀態(tài)，大部分散在的Cp G二核苷酸則可為甲基化狀態(tài)。

異常的基因甲基化可分為總體基因組的低甲基化和局部Cp G島的高甲基化。異常的基因甲基化影響基因表達(dá)，進(jìn)一步影響腫瘤發(fā)生與發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)，啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制，從而使抑癌基因失活，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展。大量研究表明抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島常出現(xiàn)高甲基化現(xiàn)象［12，13］。CpG島甲基化在CRC中是一種常見的表觀遺傳改變，如大腸腺瘤息肉基因（APC）、6－甲基鳥嘌呤－DNA 甲 基 轉(zhuǎn) 移 酶 （6－methylguanine－DNA methyltransferase，MGMT）、Ras相關(guān)區(qū)域家族1A（RASSF1A）等基因在CRC中發(fā)生Cp G島甲基化，這些基因在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管形成、DNA 修復(fù) 等方面發(fā)揮 重要功能［14－17］，甲基化使其表達(dá)異常，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

2 結(jié)直腸腫瘤的甲基化表現(xiàn)

2.1 總基因組的低甲基化 通過檢測腫瘤中的5－mC，發(fā)現(xiàn)整個(gè)基因組甲基化水平很低，其中衛(wèi)星DNA、重復(fù)序列和內(nèi)含子中的Cp G位點(diǎn)的低甲基化可能與細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)［18］，但總體基因組低甲基化的原因和作用機(jī)理尚不清楚。Chen等［19］報(bào)道當(dāng)胚胎干細(xì)胞的DNMT出現(xiàn)純合性缺失時(shí)，DNA出現(xiàn)的嚴(yán)重低甲基化（＞75%）使突變率大大提高，但這種程度的低甲基化是否在存在于CRC中，還有待進(jìn)一步證實(shí)。

特定的癌基因在CRC中也出現(xiàn)低甲基化，使癌基因（如K－ras基因）表達(dá)水平提高。異常高表達(dá)的基因表現(xiàn)為低甲基化，說明低甲基化與腫瘤的發(fā)病機(jī)制有一定聯(lián)系。研究表明，在細(xì)胞群體中，原本低甲基化的細(xì)胞形成腫瘤的趨勢相對(duì)較大，基因低甲基化可能是導(dǎo)致腫瘤形成的祖先細(xì)胞克隆擴(kuò)大的關(guān)鍵因素之一［20］。

2.2 局部CpG島的高甲基化 和整個(gè)基因組低甲基化狀態(tài)一樣，基因啟動(dòng)子區(qū)Cp G島的局部高甲基化也被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的早期事件，然而兩者的發(fā)生機(jī)制一樣亦或是來源于腫瘤發(fā)生中的不同機(jī)制［21］，目前的研究熱點(diǎn)是抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化，它是除基因突變外的另一種使基因轉(zhuǎn)錄失活的機(jī)制。Rb基因是第一個(gè)被研究證實(shí)與腫瘤相關(guān)的高甲基化基因，此后人們開始研究多種抑癌基因，并證實(shí)其啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化狀態(tài)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如細(xì)胞周期依賴性激酶抑制基因（CDKN2A）、MGMT和上皮鈣粘素（E－cadherin，CDHl）等。CRC的發(fā)生發(fā)展與很多基因的高甲基化有關(guān)，如抑癌基因、錯(cuò)配修復(fù)基因和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因等。研究表明，DNA異常甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的可逆性為從表觀遺傳角度治療腫瘤提供了理論依據(jù)［22］。

3 基因甲基化在CRC早期診斷中的應(yīng)用

DNA甲基化常發(fā)生在CRC的早期階段和癌前病變?nèi)缦倭鲋?，故可作為CRC早期診斷的指標(biāo)。正常腸黏膜每24h有l(wèi)×1010～5×1010個(gè)上皮細(xì)胞脫落，鑒于腫瘤上皮細(xì)胞快速的更新速度，每天至少有1%的細(xì)胞脫落入腸道，隨糞便排出體外?；蚰茉诩S便內(nèi)穩(wěn)定存在，且持續(xù)脫落，故微量DNA是一種很好的標(biāo)志物，并可通過擴(kuò)增技術(shù)如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）等檢測出。并且鑒于糞便檢查的無創(chuàng)性、無需腸道準(zhǔn)備、腸道任意部位性，大大提高了CRC的檢出率。尤其隨著甲基化特異性PCR技術(shù)的進(jìn)展，檢測糞便中的DNA甲基化情況可作為篩查CRC的早期途徑。目前國內(nèi)外已經(jīng)通過分析糞便基因來早期診斷CRC，Belshwa等［23］首先證實(shí)可把檢測糞便DNA甲基化水平作為早期CRC篩查的有效途徑，Muller等［24］的研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)糞便DNA甲基化檢測用于CRC篩查的良好應(yīng)用前景，并報(bào)道分析分泌性卷曲相關(guān)蛋白2（SFRP2）基因甲基化能夠檢出77%～90%的CRC。Lenhard［25］報(bào)道糞便腫瘤高甲基化基因分析診斷CRC的敏感性和特異性分別為42%、98%。黃朝暉、李莉華等［26］通過對(duì)不同人群CRC患者、結(jié)直腸腺瘤患者和正常對(duì)照者糞便中增生性息肉蛋白（HPPl）基因甲基化分析，得出HPPl基因甲基化是CRC發(fā)生發(fā)展中的早期事件并有望成為CRC早期診斷的新途徑。程之紅等［27］通過對(duì)CRC或良性病變的患者及24例正常對(duì)照者糞便SFRP2基因甲基化狀態(tài)的分析，得出SFRP2基因甲基化是CRC發(fā)生發(fā)展過程中早期事件，并有望）成為CRC早期無創(chuàng)診斷的新途徑。很多研究表明，糞便DNA甲基化檢測可作為CRC早期診斷的一種新途徑。

SFRP2是一種新的腫瘤抑制基因，在大多數(shù)CRC中表現(xiàn)出過甲基化［28，29］；Muller等［24］分析糞便 SFRP2基因甲基化水平檢出77%～90%的CRC。目前國內(nèi)研究CRC中SFRP2超甲基化發(fā)生率大于90%，對(duì)于無創(chuàng)性檢測CRC具有高度的潛力［27，30］。SFRP2基因甲基化診斷CRC的敏感度最高，但特異度低，MGMT基因甲基化的特異度最高，敏感度低，因此，聯(lián)合檢測能提高診斷的敏感度，其特異度也略有降低。所以臨床上需要篩選不同的基因組合用于糞便甲基化檢測，以同時(shí)保證高水平的診斷敏感度及特異度［31］。

T淋巴細(xì)胞成熟相關(guān)蛋白（T－cell differentiation protein，MAL）基因定位于2q13，共含有4個(gè)外顯子，其cDNA長為1051 bp。MAL是組成向頂端運(yùn)輸?shù)募?xì)胞膜和分泌性蛋白的必不可少的組成部分。Guro等［32］的研究指出，在CRC中MAL基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為80%，結(jié)直腸腺瘤為71%，正常上皮組織中為45%，在甲基化陽性的標(biāo)本中，其蛋白不表達(dá)或表達(dá)明顯降低。糞便中MAL、CDKN2A、MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平在CRC和腺瘤患者中明顯升高，其聯(lián)合檢測有望成為CRC及其癌前病變早期診斷的無創(chuàng)性檢測方法［31，33］。

MGMT是一種DNA修復(fù)酶，基因定位于10q26，全長約為170kb，含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，可以用其編碼產(chǎn)物MGMT從DNA上移除烷化劑在06位形成的06－鳥嘌呤化合物，使存在DNA損傷的細(xì)胞停止增殖，恢復(fù)DNA的結(jié)構(gòu)和功能，是機(jī)體抵抗烷化劑損傷的主要保護(hù)因素。研究表明，MGMT基因啟動(dòng)子的高甲基化是MGMT表達(dá)缺失的主要原因。消化系統(tǒng)直接接觸烷化致癌物，因此MGMT失表達(dá)在消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有更為重要的意義。有研究顯示，CRC中MGMT啟動(dòng)子區(qū)CpG島的超甲基化，導(dǎo)致MGMT失表達(dá)，基因損傷修復(fù)失敗，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［34］。有研究表明，聯(lián)合檢測HPPl和MGMT基因甲基化對(duì)進(jìn)展期腺瘤有較高的檢出率（80%），對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)和切除癌變前的腺瘤，降低CRC的發(fā)病率和死亡率具有重大的意義［31，35］。

4 結(jié)語與展望

CRC是常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率、死亡率呈逐年上升趨勢，并逐漸年輕化。目前DNA甲基化是CRC疾病發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)，鑒于CRC發(fā)生發(fā)展是多因素、多基因、多途徑共同作用的結(jié)果，且單個(gè)基因甲基化水平的敏感度不高，因此必須聯(lián)合檢測僅發(fā)生于結(jié)直腸腫瘤的多種基因的甲基化水平才可獲得理想的敏感度與特異度。進(jìn)一步研究DNA異常甲基化的機(jī)制，有助于結(jié)直腸癌的早期診斷，為結(jié)直腸癌的治療開辟新的道路。

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