劉 波(綜述)，龔其海(審校)

(遵義醫(yī)學院藥理學教研室暨貴州省基礎藥理重點實驗室,貴州 遵義 563099)

缺氧誘導因子-1：神經(jīng)保護的潛在靶標

劉 波(綜述)，龔其海(審校)

(遵義醫(yī)學院藥理學教研室暨貴州省基礎藥理重點實驗室,貴州 遵義 563099)

缺氧誘導因子-1；神經(jīng)保護；腦損傷

腦組織的氧供給與氧消耗不協(xié)調時，將會引起一系列的病理生理學變化，最終導致神經(jīng)細胞死亡。在此過程中，為了克服腦組織缺氧帶來的損傷，機體將啟動一系列細胞保護機制，包括誘導一些轉錄因子如缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)的表達。HIF-1普遍存在于哺乳動物細胞內，是調節(jié)氧平衡的重要轉錄因子。缺氧時能通過調節(jié)各種靶基因的表達產生對缺氧的適應性反應，使缺氧的神經(jīng)細胞保持一定的氧濃度，并誘導腦缺血耐受的形成，從而達到保護神經(jīng)的作用。HIF的分布和作用十分廣泛，目前已確定的靶基因有130多種,這些基因編碼的蛋白參與了血管新生與重塑、神經(jīng)再生、葡萄糖的轉運及酵解、紅細胞生成、氧化應激和炎性等多種病理生理過程。

1 神經(jīng)保護作用及其機制

腦中風之后，HIF-1為了幫助神經(jīng)細胞適應不利的環(huán)境，在轉錄水平上將產生一系列的代償性的反應，啟動一系列靶基因的表達，使細胞在缺氧環(huán)境下幸存。HIF-1在腦損傷中起著重要的作用：一方面是神經(jīng)保護作用，另一方面是神經(jīng)毒性。其關鍵點主要取決于細胞的種類和缺血的嚴重程度。HIF-1與腦缺血缺氧緊密相關，其含量可隨著氧氣的濃度而發(fā)生變化。當大鼠或小鼠缺氧達到30～60 min時，可以在大腦中檢測到HIF-1 mRNA的表達，在梗死灶可測到HIF-1 mRNA的編碼增加【1】。HIF-1是一系列神經(jīng)蛋白的調控工具，Milosevic【2】等通過敲除中腦神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)的 HIF- 1 基因發(fā)現(xiàn)其存活及分化均受損；另一方面， 低氧誘導HIF-1表達增加可促進NSCs的增殖及NSCs向神經(jīng)元方向的分化【3】。以上均提示HIF-1對神經(jīng)干細胞發(fā)育起著關鍵性作用。HIF-1對缺血缺氧神經(jīng)元重要的保護作用，是由于其誘導的基因表達可改善腦梗死后缺血半暗帶血循環(huán)和葡萄糖的運輸介導缺氧后的低氧耐受等機制實現(xiàn)。這些被誘導的基因種類眾多，包括促紅細胞生成素、血管內皮生長因子等。

1.1 促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO) HIF-1通過氧依賴途徑對EPO進行調節(jié)。EPO被證實是HIF-1的第一個靶基因【4】，同時也是隨著氧濃度下降而被激活的最具特色的靶基因【5】。EPO mRNA和蛋白存在于各種哺乳動物大腦中，EPO受體廣泛的表達于大腦的各種細胞中，如神經(jīng)元、上皮細胞、小膠質細胞和星形膠質細胞。低氧刺激時HIF-1可上調EPO等靶基因的表達，直接用EPO等預處理也可起到神經(jīng)保護作用。在嚙齒類動物缺血性腦卒中模型中,EPO可以減少腦梗死體積，改善神經(jīng)功能。Digicaylioglu等【6】研究發(fā)現(xiàn)EPO預處理可保護神經(jīng)元免遭缺血變性損害，神經(jīng)元性EPO受體激活后可通過觸發(fā)Jak2和NF-kB信號通路的“會話”而阻礙N-甲基-D-天冬氨酸受體或一氧化氮(nitric oxide，NO)誘導的凋亡。EPO介導Jak-2的激活可引起NF-KB抑制劑的磷酸化，NF-KB的核易位，促進依賴于NF-KB的神經(jīng)保護性基因的轉錄，EPO引起的這種效應可能是預處理發(fā)揮神經(jīng)元保護作用的主要因素，也間接提示HIF-1參與缺血耐受可能的途徑。缺氧誘導EPO可直接作用前腦神經(jīng)干細胞,可促進神經(jīng)元祖細胞的產生，提示EPO可能與缺氧后的神經(jīng)發(fā)生有關【7】，提示EPO對神經(jīng)元可能起著一種神經(jīng)元營養(yǎng)的作用。神經(jīng)膠質細胞是EPO激活的另一個靶子。體外實驗證實，EPO可以促進少突膠質細胞的成熟與分化，也可以促進星形膠質細胞的增殖【8】。EPO能夠改善神經(jīng)突觸傳遞氧氣和葡萄糖的能力【9】。因此EPO 可能是通過激活鈣離子通道和釋放神經(jīng)遞質而起到神經(jīng)保護作用。

研究表明EPO還可以激活及促進腦組織中脈管系統(tǒng)。在人體腦組織毛細血管中存在兩種EPO受體的mRNA參與了腦組織的血管發(fā)生，同時腦組織毛細上皮細胞對EPO存在著劑量依賴性【10】。缺氧或中風誘導時，EPO通過刺激新血管的形成，增強紅細胞的運輸，提高缺氧組織的氧含量，從而起到神經(jīng)保護的作用，抑制因為缺氧給腦組織帶來的不利影響【11】。在各種體外和體內的缺氧預處理中風模型中證明EPO還可以抑制低氧誘導的神經(jīng)元凋亡從而提高大腦對中風的耐受性【12】。研究發(fā)現(xiàn)，EPO可有效抑制半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3激活，從而抑制細胞凋亡，起到保護神經(jīng)作用，顯著抑制缺氧缺血誘導的凋亡前體基因和死亡蛋白5(death Protein 5)mRNA在腦組織中的上調，且可反轉損傷誘導的抗凋亡基因Bcl-2轉錄的下調【13】。EPO受體缺失的小鼠，在發(fā)育過程中凋亡細胞明顯增加，同時伴隨著第四腦室的發(fā)育不全【14】。其次，EPO在體外實驗中還有抗大鼠小膠質細胞凋亡的作用，所以EPO/EPO受體系統(tǒng)是腦缺血缺氧時的內源性大腦細胞的保護系統(tǒng)。UzumG等【15】發(fā)現(xiàn)在PTZ(pentylentetrazol)誘導的大鼠癲癇發(fā)作模型中，重組人類促紅細胞生成素(recombinat human erythropoietin rhEPO)抑制了血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)通透性的增加。rhEPO對BBB的保護作用是一個新發(fā)現(xiàn),其機制待進一步研究。

HIF通過調節(jié)EPO從而起到上述的神經(jīng)保護作用，其具體的分子機制還未完全明確，有待進一步研究。

1.2 血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) VEGF是HIF-1的下游調節(jié)基因之一。VEGF基因5’端增強子存在有與HIF-1結合的序列—缺氧反應元件(hypoxia response element，HRE)。缺氧時HIF-1積聚并且與DNA結合活性增加，HIF-1與VEGF基因的HRE結合后，促進VEGF轉錄和表達，并增加缺氧情況下VEGF mRNA的穩(wěn)定性。VEGF可促進內皮細胞的增殖和血管的生成，增加血管通透性，保護神經(jīng)元作用，從而起到神經(jīng)保護作用。

1.2.1 促進血管生成和內皮細胞的增殖 VEGF是HIF-1的一個重要的靶基因，也是血管生成的主要調節(jié)因子。腦缺血缺氧時，HIF-1使VEGF表達增加，促進微血管循環(huán)的重建，增加缺血組織血流灌注和供氧量，加快腦缺血缺氧的恢復過程。腦缺血時，受損的組織試圖通過VEGF促進血管發(fā)生來增加氧氣的輸送，實驗已證明中風病人梗死區(qū)域與正常人相比，隨著存活時間的延長，梗死區(qū)微血管數(shù)量也隨之增加【16】。VEGF是很強的內皮特異性絲裂原，可與內皮細胞表達的特異性VEGF受體結合，使內皮細胞增殖，從而增加血管的數(shù)量和密度，尤其是刺激缺血半暗帶的血管形成，挽救或保護缺血半暗帶中的神經(jīng)元有效的減少梗死體積和減少神經(jīng)功能缺損。Takeshi【17】等表明，HIF-1可以增強VEGF基因的轉錄活性，刺激血管生成，并明顯加速血管的生長，增強腫瘤的血管化作用，加快腫瘤細胞生長和向周圍組織的浸潤擴散。在腦中風時，由HIF-1誘導的血管生成素，如金屬硫蛋白-2，組織蛋白酶D和角蛋白是與HIF-1轉錄復合物有關的靶基因，能促進半暗帶血管的發(fā)生，促進血液的供給，故可肯定HIF-1水平增加能相應的提高這些蛋白質的含量。

1.2.2 增加血管通透性 VEGF首先是因為能增加血管通透性而被發(fā)現(xiàn)的，該作用十分強烈，用Milles檢測法，其濃度不足1 nmol/L就發(fā)揮作用，超過組胺濃度的5萬倍。VEGF可通過增加內皮細胞間隙來增加血管通透性。Kohn等研究發(fā)現(xiàn)：微血管內皮細胞的胞漿中存在著由囊、液泡組成的葡萄簇樣結構，稱為小囊葉泡器(vesiculor-vacuolor organelle，VVO)。局部注射VEGF后可觀察到VVO功能增強，提示VEGF可能是通過開啟VVO之間窗口而增加血管通透性【18】。VEGF通過增加血管通透性，使血漿蛋自溢出血管外導致血漿蛋白在血管外凝結，有利于血管形成。通過特異性RNA干擾血管內皮細胞中HIF-1α基因的表達，能顯著抑制由缺氧誘導的血管內皮細胞滲透性的增加【19】。VEGFR酪氨酸激酶抑制劑(vetanalib，PTK787)治療能夠增加VEGF的表達,提示HIF-1能夠激活促血管形成因子，從而促進血管發(fā)生和增加血管滲透性【20,21】。

1.2.3 神經(jīng)元保護作用 人類及齲齒類動物的VEGF基因存在于HRE區(qū)，是由HIF激活的。VEGF在多種損傷因素中具有神經(jīng)保護作用，對多種類型的神經(jīng)細胞具有直接的神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用。研究表明VEGF對于帕金森病(Parkinson’s disease，PD)模型大鼠的多巴胺能神經(jīng)元有一定的保護作用【22】。而Takao等研究發(fā)現(xiàn),VEGF能有效地減少由6-羥基多巴胺誘導產生的體外及體內PD模型中多巴胺能神經(jīng)元的死亡，促進血管發(fā)生以及膠質細胞增殖；同時，VEGF的神經(jīng)保護作用可能是由NP受體介導的【23】。神經(jīng)生長因子激活受體可以誘導HIF-1使VEGF表達的增加【24】。缺氧預處理新生小豬模型，HIF- 1通過上調VEGF而起到神經(jīng)保護作用【25】。VEGF還能促進神經(jīng)元的成熟，軸突的生長及小膠質細胞和星形膠質細胞的增生和遷移【26】。由此可見，HIF-1可以通過靶基因VEGF表達來保護神經(jīng)元。

1.3 葡萄糖代謝 中風將引起大腦血流量中的葡萄糖濃度下降，無氧酵解就成為細胞產生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的主要形式，是神經(jīng)細胞ATP產生的主要來源。因此，為了適應這種不利的環(huán)境，滿足神經(jīng)細胞對糖的需求，需要通過增加糖酵解酶的活性和易化葡萄糖轉運的載體，從而提高葡萄糖的濃度，起到神經(jīng)保護作用。缺氧能激活HIF-1引起葡萄糖運輸和糖酵解從而促進細胞的存活，現(xiàn)已證實許多與葡萄糖攝取及糖酵解有關的基因均為HIF-1的目的基因。在大鼠大腦中動脈阻塞模型(middle cerebral artery occlusion，MACO)中，HIF-1mRNA與乳酸脫氫酶A、磷酸果糖激酶L、丙酮酸脫氫酶M、醛縮酶A存在著時間和空間上的共同表達，其中乳酸脫氫酶A,丙酮酸脫氫酶M均為HIF-1的靶基因。這些幾乎均在腦缺血后的半暗帶區(qū)域表達，表明HIF-1通過促進葡萄糖轉運蛋白1(glucose transporter1，GLUT1)和糖酵解酶等的表達分泌而維持腦缺血半暗帶細胞的功能【27】。由HIF-1引起的GLUT1的表達，在永久性MCAO模型中從7.5h持續(xù)到24h，同時HIF-1依賴的糖酵解酶在永久性MACO后的中腦前扣帶皮層的表達也會增加【28】。烯醇化酶是糖酵解途徑中的關鍵酶，普遍存在于生物體的糖酵解代謝中，通過抑制脯氨酸羥化酶上調烯醇化酶基因的表達能對永久性MCAO起到神經(jīng)保護作用【29】。脯氨酸羥化酶蛋白抑制劑—DFO治療能增加乳酸鹽脫氫酶，烯醇化酶-1和其它糖酵解酶水平的上升，能夠抑制氧化應激誘導的細胞凋亡【30】。

1.4 調節(jié)血管緊張度 腦中風時將導致血管緊張度的調節(jié)紊亂，從而導致神經(jīng)元的死亡。誘導型一氧化氮(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是由HIF-1調節(jié)適應這種不利環(huán)境的靶基因。HIF-1的過表達可以引起iNOS的表達增加，從而減少脈管的收縮【31】。缺氧能夠誘導iNOS 和HIF-1α表達增加，而HIF-1α是上調iNOS 表達的一個關鍵因子【32】。文獻報道中風能夠啟動細胞的炎癥過程，而iNOS被證明是促凋亡的原因【33】。長久以來認為iNOS在腦缺血中都是介導神經(jīng)毒性作用，但最近文獻報道對iNOS在腦缺血以及缺血預處理誘導缺血耐受中的作用有所改變，HIF-1/iNOS系統(tǒng)可能作為保護因子參與腦缺血預處理對隨后出現(xiàn)的致死性腦梗死和機體對腦缺血的保護機制。缺血預處理后可以使iNOS的表達升高，從而誘導一氧化氮(nitric oxide，NO)的生成增多，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。Guo【34】等發(fā)現(xiàn)，敲除iNOS基因的小鼠可完全去除延遲性保護作用。最近發(fā)現(xiàn)NO還參與腦缺血后缺血組織血管的再生，田恒力等也發(fā)現(xiàn)NO可以增加兔局灶腦缺血后腦組織VEGF的表達，說明隨著iNOS的升高不一定是介導神經(jīng)毒性作用，有可能使NO濃厚升高而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，其具體的調節(jié)機制還待進一步研究。

1.5 血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1) HO-1是一種抗氧化酶，由HIF-1調節(jié)其活性。在中風時HO-1適度的表達具有神經(jīng)保護作用。HO-1有兩個分解產物：其中一氧化碳，起抗凋亡作用；膽紅素，則有強的抗氧化作用【35】。實驗證明七氟烷對大腦的保護作用有一部分是通過PI3K/Akt 途徑來上調HIF-1 和HO-1來起作用【36】。HO-1的保護作用主要取決于中風的嚴重程度。研究表明，通過HIF-1上調HO-1，可以促進細胞的存活和血管的再生，能促進特異性組織側枝血管形成【37】。

1.6 神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurophic factor，BDNF) 研究表明缺氧效應元件(hypoxia-responsive element，HRE)能夠調節(jié)腺病毒介導的BDNF的表達。缺氧時，調節(jié)BDNF中由腺病毒介導的HRE可以增加5倍【38】。常氧條件下 (21% O2)，在神經(jīng)干細胞和神經(jīng)祖細胞培養(yǎng)時增加或穩(wěn)定HIF-1 和BDNF 表達，能保護內皮細胞對抗缺血引起的細胞死亡【39】。在神經(jīng)細胞株模型中BDNF 通過激活TrkB/PI-3kinase/AKT/mTOR 途徑誘導HIF-1依賴的VEGF啟動子的激活而起到神經(jīng)保護作用。由此可見HIF-1在BDNF的基因表達中起著傳感器的作用。

1.7 神經(jīng)球蛋白(neuroglobin，Ngb) Ngb是一種氧結合的血紅素蛋白，在中風或缺氧損傷中對神經(jīng)元的存活起著重要的作用。研究表明通過氯化鈷和去鐵胺預處理能上調HIF-1和Ngb的表達，對局灶性腦缺血的小鼠模型有保護作用【40,41】。最近研究表明Ngb有可能是由HIF-1來調控的。利用HIF基因敲除和病毒介導的HIF基因過表達技術，經(jīng)過神經(jīng)細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)HIF基因敲除后Ngb減少，HIF基因過表達Ngb增加【42】。研究發(fā)現(xiàn)NF-κB、特異蛋白1和HIF-1 在缺氧時可以上調大鼠Ngb基因的表達【43】。在Ngb基因5’端非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了多條HIF-1結合位點相同序列，提示Ngb可能為HIF-1的靶基因。Ngb是否是HIF-1的靶基因還需要進一步研究證明。

1.8 對其它下游基因的影響 中風時，腦內的谷氨酸濃度增高，從而引起興奮性中毒，甚至腦內細胞的損傷或中毒。最近研究表明，缺氧時，HIF-1表達增加對星形膠質細胞形態(tài)的維持和成活力有保護作用，抵抗谷氨酸的毒性作用。缺氧上調線粒體運動調節(jié)器，它是一種HIF下游調節(jié)基因，在線粒體在神經(jīng)細胞與星形細胞的運輸中起著重要的作用。它能調節(jié)線粒體軸突的運動，當線粒體運動調節(jié)器缺乏時，線粒體在軸突減少，同時線粒體將向相反的方向運動，所以它在線粒體異常引起的損傷中起著重要的作用【44】。

2 HIF-1的不利影響

HIF-1并不是百利而無一害，在神經(jīng)學疾病發(fā)生時，HIF也會帶來一些不利的影響。HIF-1可以通過誘導水通道蛋白-4、水通道蛋白-9的分子途徑引起腦水腫，用藥理學方法阻斷這條途徑可以為中風病人提供新的治療策略【45】。HIF-1可以通過水通道蛋白-4、基質金屬蛋白酶-9分子途徑促使腦水腫形成及血腦屏障的破裂【46】。對于水通道蛋白的研究成為了近年熱點。

炎癥相關因子如白介素-20(interleukin-20，IL-20)，白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)是由HIF調控的，充分的證據(jù)表明HIF-1表達增加能促進IL-20參與到中風的發(fā)病中，通過2-甲氧基雌二醇抑制HIF-1減低IL-20的表達而起到神經(jīng)保護作用【47】。BNIP、BNIP3是Bcl-2家族成員，在缺氧時被激活【48】。Regula KM等【49】提出腺病毒E1B19000相互作用蛋白3在啟動子部位含有HRE，這證實其是HIF-1的一個直接的靶基因，它的激活能引起細胞膜的去極化和線粒體通透性轉換孔開放【50】，從而導致中風和心肌細胞的死亡。HIF-1是否給中樞神經(jīng)系統(tǒng)帶來的不利影響主要是受到腦缺血缺氧程度的影響。

3 展望

HIF-1是人類腦缺血缺氧疾病中起著缺氧基因表達的總管家的作用，了解其在腦缺血缺氧性疾病中的作用機制可為這類疾病的有效治療提供新的思路和方法。近幾年對HIF-1的調控系統(tǒng)研究取得迅速進展，但準確調節(jié)機制還不是很明確。因此無論是在基礎還是臨床方面HIF-1都有待于進一步研究，為后續(xù)針對HIF-1為靶標開發(fā)神經(jīng)保護劑提供新策略。

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教育部創(chuàng)新團隊項目(NO：IRT1197)；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃項目(NO:NCET-11-0927)；國家自然科學基金資助項目(NO:81060349)；貴州省科技廳社會攻關計劃項目【NO:黔科合SY字(2008)3040】。

龔其海，男，博士，教授，研究方向：神經(jīng)藥理學，E-mail:gqh@zmc.edu.cn。

R971

A

1000-2715(2012)05-0452-06

【收稿2012-08-16；修回2012-09-16】

(編輯：王福軍)