盧忠義(綜述)，宋 鴻(審校)

(遵義醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

金黃色葡萄球菌生物膜的研究進(jìn)展

盧忠義(綜述)，宋 鴻(審校)

(遵義醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

金黃色葡萄球菌；生物膜；感染

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)常引起皮膚黏膜及多種組織器官的化膿性炎癥，是醫(yī)院內(nèi)交叉感染的重要病原菌之一，也是生物膜感染常見的病原菌。由于細(xì)菌形成生物膜后其生物學(xué)性狀、致病性及免疫性均發(fā)生明顯變化，使感染慢性化并難以控制,為臨床防治帶來極大困難。因此，本文根據(jù)近年來的文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的形成、結(jié)構(gòu)及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)綜述。

1 生物膜的定義及形成過程

生物膜(Bacterial biofilm，BF)是細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中為了適應(yīng)環(huán)境的變化而附著在機(jī)體組織或生物材料表面形成的一種與浮游細(xì)菌相對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)方式，是由細(xì)菌群落和細(xì)胞外基質(zhì)所構(gòu)成，細(xì)菌一旦形成生物膜其生長(zhǎng)、基因表達(dá)及蛋白質(zhì)產(chǎn)物都會(huì)發(fā)生改變【1】。生物膜厚度的變化范圍可以從一個(gè)單層細(xì)胞到許多黏液性多聚物包裹的細(xì)胞群落。對(duì)生物膜結(jié)構(gòu)的分析顯示，在某些情況下高密度的生物膜微菌落可以形成獨(dú)特的柱狀或蘑菇狀結(jié)構(gòu)。然而，也有一些生物膜結(jié)構(gòu)的形成卻依賴于環(huán)境因素【2】。生物膜通過錯(cuò)綜復(fù)雜的通道網(wǎng)絡(luò)為更深層的細(xì)菌輸送基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提供細(xì)菌代謝所需。雖然生物膜的形成不是持續(xù)感染的先決條件，但要清除卻很困難，往往需要外科手術(shù)，因此對(duì)于生物膜的預(yù)防及消除還有待進(jìn)一步研究。

金黃色葡萄球菌是一種分布廣泛的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，常存在于人體前鼻腔。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有20%～25%人群是金黃色葡萄球菌的長(zhǎng)期宿主，75%～80%人群是間歇性宿主或從未侵入金黃色葡萄球菌【3,4】。之前的研究顯示，鼻腔帶菌與院內(nèi)感染的增多有極大的因果關(guān)系。鼻腔為金黃色葡萄球菌提供了一個(gè)集結(jié)地去播散細(xì)菌，一旦細(xì)菌經(jīng)破損的上皮進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，細(xì)菌開始繁殖，黏附因子表達(dá)也開始上調(diào)，侵入的葡萄球菌有可能被先天免疫防御系統(tǒng)清除，也有可能黏附于宿主細(xì)胞外基質(zhì)蛋白形成生物膜。生物膜的形成最初來源于單個(gè)細(xì)胞，但在形成生物膜的過程中細(xì)胞的生理學(xué)特性逐漸向生物膜轉(zhuǎn)變，在整個(gè)細(xì)菌群落形成過程中環(huán)境因素可以促進(jìn)不同子群體生長(zhǎng)，而在生物膜中由于受氧氣、營(yíng)養(yǎng)、電子受體梯度的影響可以導(dǎo)致差異的基因表達(dá)【5】。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌生物膜中的細(xì)菌可以同時(shí)存在四種代謝方式：需氧生長(zhǎng)型，發(fā)酵型，休眠型(包括生長(zhǎng)緩慢和停滯的細(xì)菌)和死亡細(xì)菌。位于表層氧氣豐富的地方和下層營(yíng)養(yǎng)豐富區(qū)域的細(xì)菌代謝比較活躍【5】。然而，絕大多數(shù)細(xì)胞是位于一個(gè)靜止和缺氧環(huán)境下。此外，已證實(shí)了生物膜差異蛋白的表達(dá)跟多種細(xì)胞壁相關(guān)蛋白有關(guān)。在某些情況下，生物膜中細(xì)胞簇的這種差異表達(dá)可以設(shè)想為細(xì)胞間的基礎(chǔ)。

生物膜嵌入有機(jī)組織生長(zhǎng)的方式，比其浮游細(xì)胞更容易從周圍獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。生物膜細(xì)胞外基質(zhì)可以隔離和濃縮環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如氧、氮、磷酸鹽等。細(xì)菌生物膜形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，從最初的細(xì)菌定植到后來的粘附、聚集、分化成熟直到最后的播散，整個(gè)過程經(jīng)歷了五個(gè)具有不同特點(diǎn)的階段。細(xì)菌首先在生物體或聚合物表面粘附，而后由于細(xì)胞間的相互作用聚集形成細(xì)菌團(tuán)塊，隨著細(xì)菌的逐漸增多而形成相對(duì)成熟穩(wěn)定的生物膜結(jié)構(gòu)，隨后生物膜中部分細(xì)菌離開菌群向遠(yuǎn)處播散，啟動(dòng)又一個(gè)生物膜形成過程。有學(xué)者認(rèn)為，生物膜中的細(xì)胞存在一種選擇優(yōu)勢(shì)(selective advantage)，其中部分細(xì)菌處于一種有利于播散的狀態(tài)，在生存環(huán)境變化時(shí)即離開生物膜群體到更適宜的環(huán)境中定植。生物膜的播散有三種可能的形式：群游播散(swarming dispersal)、團(tuán)塊播散(clumping dispersal)和表面播散(surface dispersal )。但目前對(duì)于生物膜播散的調(diào)控機(jī)制仍不十分明確。

2 生物膜形成相關(guān)基因

金黃色葡萄菌可形成多層生物膜，生物膜中包裹了多種生物大分子如多糖、蛋白、DNA等，其生物膜的形成受到多種因子調(diào)節(jié)如多糖細(xì)胞間黏附素(poly- saccharide intercellular antigen，PIA)、葡萄球菌附屬基因調(diào)節(jié)子(staphylococal accessory regulator，sarA)，附屬基因調(diào)節(jié)器(accessory gene regulator，agr)、細(xì)胞外DNA(extracellular DNA，eDNA)等。

2.1 多糖細(xì)胞間黏附素(PIA) PIA是金黃色葡萄球菌生物膜形成中最重要的因子，PIA是由胞間黏附素(intercellular adhesion，ica)操縱子表達(dá)產(chǎn)物共同催化合成的，由高分子質(zhì)量多聚N-乙酰葡糖胺所組成，在生物膜形成聚集階段起胞間黏附的作用。研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌生物膜的形成存在著PIA依賴和PIA非依賴兩條途徑。

2.1.1 PIA依賴的生物膜形成ica基因座定位于細(xì)菌染色體，包括icaR調(diào)節(jié)基因及串聯(lián)存在的icaA、icaB、icaC和icaD基因，其中icaA、icaB、icaC和icaD基因形成操縱子icaABCD，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為IcaA、IcaB、IcaC和IcaD四種蛋白，幾乎100%的金黃色葡萄球菌臨床分離株中都存在Ica操縱子。icaABCD操縱子的調(diào)控受到多種環(huán)境因素的影響，如 CO2、氧氣、葡萄糖、乙醇、溫度、滲透壓及抗生素(如四環(huán)素)等 。研究發(fā)現(xiàn)icaABCD操縱子及其產(chǎn)物表達(dá)上調(diào)反應(yīng)了細(xì)菌在缺氧條件下生長(zhǎng)，如生物膜形成環(huán)境中【6】。這是由于在缺氧條件下呼吸反應(yīng)調(diào)節(jié)因子SrrAB與icaADBC操縱子上游100bp處DNA序列相結(jié)合，激活PIA調(diào)節(jié)細(xì)胞的胞間粘附，可以使葡萄球菌在生物膜上聚集形成多層細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)在表皮葡萄球菌的等位基因中，25%～30%變異株ica調(diào)節(jié)的發(fā)生是由于插入序列256(insertion sequence，IS256)發(fā)生相位變異，導(dǎo)致了回復(fù)突變，這種現(xiàn)象在一些金黃色葡萄球菌中也同樣出現(xiàn)【7】。此外，PIA的表達(dá)還受到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子TcaR抑制。然而，敲除tcaR基因并不會(huì)影響PIA的合成【7】。環(huán)境因素對(duì)ica的調(diào)節(jié)主要是通過對(duì)IcaR的作用，IcaR是位于ica操縱子上游的icaR 編碼的一個(gè)抑制因子。結(jié)合ica啟動(dòng)子和敲除icaR基因可以促進(jìn)ica相關(guān)基因的表達(dá)【8】。除了IcaR 的調(diào)節(jié)外，還有其他的調(diào)控元件參與。

2.1.2 PIA非依賴的生物膜形成 盡管ica操縱子在生物膜形成發(fā)展中有著重要的作用，但葡萄球菌生物膜的形成卻存在著另一條ica非依賴途徑。arlRS雙組件系統(tǒng)可以抑制生物膜發(fā)展，當(dāng)敲除arlRS基因可以促進(jìn)細(xì)胞粘附和PIA表達(dá)【9】。然而，生物膜的形成不會(huì)受到arlRS基因和ica操縱子雙重缺失的影響，這提示了在這種雙重缺失突變菌株中PIA并不是生物膜形成所必須的【9】。研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌臨床分離株—UAMS-1，在體外試驗(yàn)或體內(nèi)導(dǎo)管感染模型試驗(yàn)中，甚至ica簇發(fā)生突變，都不會(huì)減弱生物膜的形成【10】。 在生物膜感染模型中，ica缺失會(huì)減少PIA的表達(dá)，但不會(huì)降低毒力【11】。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ica缺失，不會(huì)影響甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)BH1CC生物膜的形成，然而另一些突變株卻失去了形成生物膜的能力。值得一提的是，依據(jù)對(duì)甲氧西林敏感性，將金黃色葡萄球菌ica操縱子缺失突變株分為MRSA和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(Methicillin sensitive staphylococcus aureus，MSSA)，MRSA菌株能夠形成生物膜，相反MSSA菌株形成生物膜能力卻很弱。這些數(shù)據(jù)顯示，在ica的非依賴途徑中生物膜形成具有菌株特異性。此外，研究發(fā)現(xiàn)葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A,SPA)是ica操縱子缺失突變株生物膜形成的必須因素。在SPA缺陷突變株中加入外源性SPA可以恢復(fù)生物膜的形成能力。纖維粘連蛋白結(jié)合蛋白(fibronectin-binding proteins，F(xiàn)nBPs)在生物膜的形成中也起到重要作用。在表皮葡萄球菌中，PIA非依賴途徑生物膜形成可通過聚集相關(guān)蛋白(accumulation-associated protein，Aap)的調(diào)節(jié)。除此之外，生物膜相關(guān)蛋白(biofilm-associated protein，Bap)也與金黃色葡萄球菌生物膜的形成有關(guān)。這些研究顯示在ica非依賴的生物膜形成中細(xì)胞間粘附蛋白可以代替PIA介導(dǎo)生物膜的形成。

2.2 eDNA與生物膜的形成 葡萄球菌生物膜的另一個(gè)重要組份是eDNA，它最早是在銅綠假單胞菌生物膜中發(fā)現(xiàn)的。在體外采用DNA酶可以清除早期的、未成熟的生物膜，而臨床使用DNA酶聯(lián)合抗生素成功治愈了囊性纖維化患者，并且發(fā)現(xiàn)在皮膚細(xì)胞中有DNA酶存在可以減少生物膜的形成，這些現(xiàn)象說明了eDNA是生物膜的重要組成成分。cidA是一種編碼胞壁質(zhì)水解酶活性效應(yīng)器及調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的基因，Rice【12】等研究發(fā)現(xiàn)cidA的突變可以導(dǎo)致生物膜整個(gè)基因組DNA水平降低、粘附性下降。DNA酶I對(duì)cidA突變株生物膜形成的影響很小，而對(duì)其親代菌株則表現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng)。cidA基因已經(jīng)被證實(shí)是一種與細(xì)胞裂解有關(guān)的穿孔素同源基因，這些資料表明DNA釋放和生物膜的發(fā)展都必需依賴于細(xì)胞裂解【12】。此外，研究也發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的裂解和隨后基因組DNA的釋放都必須發(fā)生在生物膜形成早期—細(xì)胞粘附階段。eDNA不僅參與生物膜的形成，eDNA還能通過螯合陽(yáng)離子增加生物膜的耐藥性【13】。

lrg是另一種與胞壁質(zhì)水解酶和細(xì)胞死亡有關(guān)的調(diào)節(jié)基因，研究發(fā)現(xiàn)lrgAB菌株發(fā)生突變，可以通過提高生物膜粘附力及相關(guān)eDNA表達(dá)，而抵消cidA基因介導(dǎo)的DNA釋放效應(yīng)。在金黃色葡萄球菌生物膜還普遍存在著另外一些上調(diào)基因，如自溶素和噬菌體基因組。因此，金黃色葡萄球菌可以通過多種模式釋放eDNA形成生物膜。細(xì)胞裂解與eDNA的釋放將成為金黃色葡萄球菌生物膜復(fù)雜調(diào)節(jié)機(jī)制的另一個(gè)重要研究方向。

2.3agr與sarA調(diào)控生物膜的形成agr和sarA是金黃色葡萄球菌生物膜形成中主要的總體性調(diào)節(jié)因子。一種雙組件調(diào)節(jié)感受器由arlRS編碼，是應(yīng)答調(diào)節(jié)器OmpR-PhoB家族成員，受到agr和sarA基因調(diào)節(jié)。當(dāng)基因表達(dá)上調(diào)時(shí)，arlS基因產(chǎn)物可能通過影響肽聚糖水解酶的活性而調(diào)節(jié)細(xì)菌黏附于聚合物表面，阻礙生物膜形成。與浮游菌相比，生物膜中sarA基因表達(dá)上調(diào)，而在sarA突變株中生物膜形成能力降低。當(dāng)sarA突變株中nuc基因和胞外蛋白酶轉(zhuǎn)錄上調(diào)時(shí)，同時(shí)使耐熱核酸酶和nuc基因發(fā)生突變，或加入蛋白酶抑制劑，能使sarA突變株恢復(fù)生物膜形成能力【14】。通過抑制nuc基因表達(dá)或蛋白酶活性，sarA基因可以阻礙生物膜結(jié)構(gòu)中兩個(gè)重要組分—eDNA和蛋白質(zhì)降解。

雖然，SarA蛋白一方面影響agr基因表達(dá)，另一方面又受到agr基因調(diào)控，但agr基因的突變對(duì)生物膜形成影響卻很小，研究發(fā)現(xiàn)還存在著另一種不依賴于agr的對(duì)生物膜形成進(jìn)行調(diào)節(jié)的方式【15,16】。盡管如此，這些研究仍顯示了agr基因與生物膜形成是相關(guān)的。Agr群體感應(yīng)系統(tǒng)是細(xì)胞壁相關(guān)粘附因子的下調(diào)基因【17】，它將導(dǎo)致細(xì)菌粘附性降低，影響生物膜早期形成。因此，agr的抑制是生物膜形成所必需的，而通過細(xì)胞外成熟的“自動(dòng)引導(dǎo)多肽(Auto-inducing peptides，AIP)”激活agr系統(tǒng)可導(dǎo)致成熟生物膜的散播【18】，由于蛋白酶抑制劑和抑制的AIP阻礙生物膜散播，因此這種機(jī)制的產(chǎn)生往往依賴于蛋白酶及激活agr系統(tǒng)【18,19】。此外，agr基因使類似洗滌劑肽和核酸酶表達(dá)上調(diào)，這樣看起來可以增加生物膜的播散。

總之，在一種互補(bǔ)和對(duì)立的模式中葡萄球菌的總體性調(diào)節(jié)因子功能通過抑制核水解和蛋白胞外酶，sarA基因能促進(jìn)細(xì)菌黏附及早期生物膜的形成，一旦生物膜達(dá)到一定的感知密度，agr基因表達(dá)導(dǎo)致許多毒力因子上調(diào)阻礙宿主免疫應(yīng)答，此外，agr基因以一種核酸酶、蛋白酶及洗滌劑依賴方式使生物膜播散。

3 展望

金黃色葡萄球菌形成生物膜是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要多種因子的參與，并受到多種基因及其產(chǎn)物的共同調(diào)控。但目前國(guó)內(nèi)對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的研究主要集中在對(duì)粘附現(xiàn)象的觀察、對(duì)生物材料表面抗粘附的研究及生物膜形成階段、組成及生物膜所導(dǎo)致相關(guān)疾病的研究上，而對(duì)生物膜形成基因調(diào)控方面的研究明顯不足。因此，需要更加深入地探索與金黃色葡萄球菌生物膜形成相關(guān)的機(jī)制基因組，為臨床有效治療金黃色葡萄球菌引起的感染提供新的理論參考。

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貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合G字LKZ【2011】37)。

宋鴻，女，副教授，研究方向：病原微生物與疾病研究，E-mail:song-77@qq.com。

R378.99

A

1000-2715(2012)05-0464-04

【收稿2012-08-28；修回2012-09-15】

(編輯：王福軍)