李雪麗，劉建勛

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實驗研究中心，北京 100091;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

心肌缺血/再灌注(ischaemia/reperfusion，I/R)可引起心肌代謝功能紊亂，并導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重受損甚至死亡，大量研究證明線粒體對該過程起重要的調(diào)控作用。I/R破壞線粒體穩(wěn)態(tài)平衡進而引起結(jié)構(gòu)和功能的改變是導(dǎo)致I/R損傷的關(guān)鍵因素，研究和闡明線粒體參與I/R損傷的機制，對心肌I/ R損傷線粒體保護新途徑的發(fā)現(xiàn)和減輕I/R損傷，改善心?；颊叩念A(yù)后具有重要意義。

1 心肌缺血/再灌注導(dǎo)致的線粒體失衡

1.1 I/R損傷中線粒體ROS的大量生成 過去幾十年，大量研究證明，心肌缺血時有少量活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，而再灌注初期會產(chǎn)生大量的ROS，線粒體不僅是ROS損傷的主要靶點更是ROS產(chǎn)生的主要位點。心肌細(xì)胞內(nèi)，約0.2%～2.0%的分子氧通過復(fù)合物Ⅰ和復(fù)合物Ⅲ的電子傳遞生成超氧化物。缺血時產(chǎn)生的少量ROS可導(dǎo)致電子傳遞鏈的破壞并促進ROS的進一步產(chǎn)生;再灌注時氧濃度的瞬間增高加上高效的氧化磷酸化作用，促使線粒體ROS爆發(fā)性生成。通過抑制上游位點電子傳遞(尤其是復(fù)合物Ⅰ)或使用解偶聯(lián)劑可減少I/R損傷，這種保護作用可能是通過減少線粒體ROS的產(chǎn)生實現(xiàn)的。

近年來，研究者提出了線粒體通過增加自身ROS對最初生成的ROS起正反饋作用的觀點，被稱作是ROS誘導(dǎo)的ROS釋放(ROS-induced ROS release，RIRR)［1］，最初升高的ROS可誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的開啟和線粒體去極化，從而產(chǎn)生源于線粒體電子傳遞鏈短暫的ROS爆發(fā)性生成，采用米酵菌酸抑制mPTP則能夠同時抑制線粒體膜電位(△Ψm)的下降和第二階段ROS的爆發(fā)性生成［1］;另外，Aon等［2］發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)膜陰離子通道(inner membrane anion channel，IMAC)與RIRR密切相關(guān)，IMAC抑制劑能夠阻止ROS的爆發(fā)性生成，此外，該通道受線粒體苯二氮卓類受體(mitochondrial benzodiazepine receptor，mBzR)調(diào)節(jié)，mBzR拮抗劑也能夠抑制RIRR。由RIRR途徑產(chǎn)生的ROS可導(dǎo)致△Ψm下降和動作電位的穩(wěn)定喪失，被認(rèn)為是新發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致I/R損傷的重要介質(zhì)。

1.2 線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的失衡 線粒體對心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)發(fā)揮關(guān)鍵作用，I/R所引起的線粒體功能障礙和線粒體Ca2+超載是導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的重要原因。正常情況下，心肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum，SR/ER)Ca2+釋放位點附近分布有豐富的線粒體，可通過Ca2+單輸送通道捕獲大量的Ca2+，該轉(zhuǎn)運機制僅通過△Ψm來驅(qū)動，不與其他離子交換或共轉(zhuǎn)運。線粒體Ca2+濃度對細(xì)胞質(zhì)Ca2+的迅速回應(yīng)是通過Na+/Ca2+交換(Na+/ Ca2+exchanger，NCX)和H+/Ca2+交換(H+/Ca2+exchanger，HCX)實現(xiàn)的，二者分別通過Na2+和H+進入線粒體驅(qū)動Ca2+的排出，維持線粒體基質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)和SR/ER的內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)。然而，當(dāng)單輸送通道攝入的Ca2+濃度增加至NCX活力被飽和時，就會導(dǎo)致線粒體Ca2+超載。

研究證明，缺血時線粒體Ca2+濃度有少量升高，Griffihs等［3］觀察到這可能與NCX逆轉(zhuǎn)有關(guān)，采用Clonazepam(一種線粒體NCX抑制劑)可抑制缺血時線粒體Ca2+的增加;再灌注過程中線粒體Ca2+的濃度可升高4－5倍，而且這種高水平可以維持到再灌注后1h以上，這時再給予Clonazepam則增加線粒體Ca2+水平，這是因為氧的恢復(fù)使NCX的功能也逐漸恢復(fù)正常。目前研究認(rèn)為，缺血時呼吸作用底物和氧利用受限造成的△Ψm下降、細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度的升高以及mPTP的開啟均會影響線粒體Ca2+平衡。Griffihs等［3］發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素A(cyclosporin A，CsA)(一種mPTP抑制劑)可通過降低mPTP對Ca2+的敏感性對心肌細(xì)胞起保護作用，但Juhaszova等［4］的研究證明Ca2+濃度的增加并不能增強mPTP對ROS的敏感性。因此關(guān)于Ca2+介導(dǎo)心肌細(xì)胞mPTP開啟作用的觀點尚存在爭議，需要進一步的體內(nèi)實驗來證實。

1.3 線粒體膜通透性改變

1.3.1 內(nèi)膜通透性改變 線粒體內(nèi)膜(inner mitochondrial membrane，IMM)通透性極低，幾乎所有的離子甚至質(zhì)子都不能通過，基質(zhì)成分和代謝物必須在載體蛋白或高選擇性通道的協(xié)助下才能實現(xiàn)跨膜運輸，這種“不透性”對ATP的生成和△Ψm的維持起重要作用。關(guān)于內(nèi)膜在線粒體膜通透性改變過程中的作用是有爭議的［5－6］，但大多數(shù)研究認(rèn)為這種作用是存在的，mPTP是內(nèi)膜實現(xiàn)通透性轉(zhuǎn)換的主要機制。mPTP是一種多蛋白復(fù)合體，主要由位于內(nèi)膜的腺苷酸轉(zhuǎn)運蛋白(adenine nucleotide translocator，ANT)、外膜的電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)和基質(zhì)的親環(huán)素D(cyclophilin D，Cyp-D)及細(xì)胞質(zhì)的己糖激酶(hexokinase，HK)組成，所形成孔道具有電壓依賴性和高傳導(dǎo)性，全部開啟時孔徑為3 nm，可允許分子量小于1.5 kDa的物質(zhì)被動擴散通過線粒體內(nèi)膜。mPTP的不可逆高水平開放，直接導(dǎo)致△Ψm不可逆降低，氧化磷酸化解耦聯(lián)，離子平衡失調(diào)，線粒體腫脹和ATP水解，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［7］。

大量研究證明，心肌I/R可誘導(dǎo)mPTP開放，并且該現(xiàn)象更多發(fā)生于再灌注初期，因為該階段線粒體ROS的爆發(fā)性生成、Ca2+迅速聚集以及pH值的逐漸升高均為mPTP的開放提供了最佳環(huán)境。mPTP的開放導(dǎo)致的IMM通透性增加及細(xì)胞色素C(cytochrome C，CytC)、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)等釋放，介導(dǎo)了一系列細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜及細(xì)胞核有關(guān)的蛋白質(zhì)切割水解，若mPTP持續(xù)高水平開放則直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死;一定程度的開放和隨后的及時關(guān)閉可致使細(xì)胞凋亡［7］。

1.3.2 外膜通透性改變 正常情況下，線粒體外膜(outer mitochondrial membrane，OMM)對膜間隙蛋白是不通透的，通過檢測典型膜間隙蛋白(如CytC，AIF)的亞細(xì)胞定位，可間接反應(yīng)OMM的通透性變化。進一步的研究表明［8－10］，當(dāng)OMM通透性增加時，procaspases、Smac/Diablo、Omi/Htr2A和EndoG等關(guān)鍵性蛋白也被釋放到細(xì)胞質(zhì)并轉(zhuǎn)移到核內(nèi)或與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的受體相互作用，通過多種途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的死亡過程，其中包括caspase的激活，代謝改變，氧化磷酸化破壞，非caspase依賴性的細(xì)胞凋亡等。CytC是最常見的線粒體釋放蛋白之一，可與Apaf-1、dATP及caspase-9結(jié)合成凋亡復(fù)合體，激活caspase-9及下游效應(yīng)物，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。AIF是非caspase依賴性效應(yīng)物，釋放后快速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核使染色質(zhì)凝聚和DNA片段化，有研究報道［11］在I/R心肌細(xì)胞核碎片和胞質(zhì)中檢測到了AIF，缺血預(yù)處理可減弱AIF的釋放。Bahi等［12］發(fā)現(xiàn)缺血可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞線粒體EndoG的釋放及核轉(zhuǎn)移，用特異性siRNA置換EndoG可減少DNA片段化，但也有研究顯示EndoG缺失的小鼠其細(xì)胞死亡和DNA斷裂沒有明顯變化［13］，從這些小鼠分離到的細(xì)胞對各種凋亡刺激的易感性沒有明顯差異［14］。因此，EndoG在I/R心肌細(xì)胞凋亡中的作用還需要深入的研究。

1.4 線粒體形態(tài)的改變 近年來，隨著熒光成像和三維成像技術(shù)的發(fā)展，對線粒體形態(tài)的認(rèn)識也更加深入。線粒體的管網(wǎng)狀組織是高度動態(tài)化的，通過持續(xù)的、相對獨立的分裂和融合事件維持的動態(tài)平衡對應(yīng)答細(xì)胞不同生理需求具有非常重要的意義。

最近的研究證明，心肌I/R損傷與線粒體的形態(tài)變化相關(guān)，I/R過程中線粒體分裂融合的動態(tài)平衡被破壞，線粒體趨向于分裂并發(fā)生片段化。Brady等［15］對培養(yǎng)的HL-1細(xì)胞模擬缺血刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的線粒體片段化，復(fù)氧時也發(fā)生同樣變化，并證明片段化的發(fā)生與發(fā)動蛋白相關(guān)蛋白1 (dynamin-related protein-1，Drp1)的活化和線粒體轉(zhuǎn)移相關(guān)，給予SB203580(p38MAPK藥理抑制劑)可使線粒體再融合和恢復(fù)管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。目前，缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體片段化機制還不清楚，可能與細(xì)胞鈣超載、ROS的產(chǎn)生和mPTP的開放有關(guān)。Plotnikov等［16］采用抗氧化劑能夠抑制缺血誘導(dǎo)的線粒體分裂。Hom等［17］發(fā)現(xiàn)毒胡蘿卜內(nèi)酯(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+攝取抑制劑)或KCl引起的細(xì)胞鈣超載可促進心肌細(xì)胞線粒體分裂增加。Cereghetti［18］和 Han等［19］進一步研究顯示細(xì)胞內(nèi)鈣超載可分別通過激活磷酸酶、鈣神經(jīng)素或激活Ca2+/ CaMKIα途徑使Drp1去磷酸化而活化并轉(zhuǎn)移到線粒體誘導(dǎo)線粒體分裂。此外，也有研究證明［20］，mPTP的開放可能導(dǎo)致Drp1介導(dǎo)的線粒體分裂，相反抑制線粒體分裂或促進線粒體融合的同時mPTP的開放程度減弱，因此認(rèn)為該機制也參與了I/R心肌保護作用。

線粒體的分裂、融合過程受多種蛋白的精確調(diào)控，Mfn1和Mfn2是參與線粒體外膜融合的關(guān)鍵蛋白，內(nèi)膜的融合主要是由Dynamin家族蛋白Mgmlp/OPA1介導(dǎo)，Drp1/Dnmlp、Fisl/Fislp、Caf4p和Mdvlp參與線粒體分裂的調(diào)控。目前，抑制I/R過程中線粒體片段化的新策略之一是通過干預(yù)關(guān)鍵蛋白的表達。Ong等［20］用線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2及Drp1K38A(Drp1的顯性突變結(jié)構(gòu))轉(zhuǎn)染HL-1細(xì)胞，結(jié)果顯示管網(wǎng)狀形態(tài)的線粒體有所增加，細(xì)胞I/R損傷減弱;Chen等［21］研究發(fā)現(xiàn)，缺血誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞線粒體分裂與線粒體融合蛋白OPA1的水平降低有關(guān)，但OPA1的過表達卻不能保護缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

目前，線粒體形態(tài)變化與疾病發(fā)生相關(guān)性的研究仍是熱點，深入闡明線粒體分裂與I/R過程中鈣超載、ROS產(chǎn)生及mPTP的開放之間的相互作用，將為心肌I/R損傷的防治提供新的途徑。

2 線粒體在心肌缺血/再灌注損傷中的保護作用

2.1 線粒體ATP敏感性鉀通道的保護作用 線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive K+，mKATP)的生理作用是一方面維持線粒體內(nèi)K+平衡，從而控制線粒體基質(zhì)容積的改變;另一方面通過K+的再攝取部分補償質(zhì)子泵產(chǎn)生的電荷轉(zhuǎn)移，從而維持跨膜電位差和pH梯度的穩(wěn)態(tài)。大量研究認(rèn)為，mKATP開放具有心肌保護作用，mKATP開放劑可模擬缺血預(yù)處理的心肌保護效應(yīng)，相反給予阻斷劑保護作用減弱或消失。據(jù)報道，mKATP的開放可減少線粒體Ca2+的攝入和mPTP的開放［22］，也能夠增加電子傳遞鏈ROS的產(chǎn)生(短暫缺血和再灌注時產(chǎn)生的低水平的ROS被認(rèn)為在IPC中起重要作用)［23－24］。此外，mKATP開放后，K+內(nèi)流線粒體內(nèi)滲透壓升高，基質(zhì)容積增加，并直接影響能量代謝，促進ATP的生成，這一過程對I/R過程中細(xì)胞的自身保護也起到積極作用。

2.2 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的保護作用 目前，mPTP被認(rèn)為是防治心肌I/R損傷的重要靶點，大量實驗證明，通過直接干預(yù)孔道組成成分或間接減少孔道開啟誘因(如ROS、Ca2+和pH)，抑制mPTP的開啟，對心肌I/R損傷具有明顯的保護作用［25－26］。

Cyp-D是mPTP的主要成分，對mPTP的開放起關(guān)鍵調(diào)控作用，缺失Cyp-D的小鼠對Ca2+和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的mPTP開放更具有抵抗力，I/R損傷也有所減少［27］。CsA是Cyp-D抑制劑，研究表明CsA對心肌I/R損傷具有同樣的保護作用，可減少缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡［28］，減小I/R心肌梗死面積［29］。研究證實，IPC的保護作用與其抑制再灌注初期mPTP的開放密切相關(guān)。Javadov等［25］采用3H-DOG技術(shù)，證明了IPC能夠抑制再灌注初期mPTP的開放，并促進其隨后的關(guān)閉。目前，mPTP的結(jié)構(gòu)成分尚未完全確定，對其結(jié)構(gòu)和功能的深入研究將有利于闡明mPTP參與I/R損傷的作用機制和新靶點發(fā)現(xiàn)。

3 展望

綜上所述，線粒體的完整性對心肌細(xì)胞的存活至關(guān)重要。心肌I/R過程使線粒體各種穩(wěn)態(tài)平衡均發(fā)生嚴(yán)重改變，并且這些因素相互影響，形成惡性循環(huán)，從多種途徑參與了心肌I/R損傷的發(fā)生。目前，mKATP和mPTP作為心肌I/R損傷線粒體保護途徑的重要靶點已被廣泛研究，并顯示良好的心肌保護作用。線粒體RIRR途徑產(chǎn)生的ROS、膜通透性的改變以及線粒體形態(tài)的改變是近年來發(fā)現(xiàn)的參與心肌I/ R損傷的重要機制，抑制或減小這些改變均能改善心肌I/R損傷。隨著研究的深入和I/R損傷線粒體機制的進一步闡明，直接或間接保護線粒體完整性，維持和控制線粒體穩(wěn)態(tài)平衡，增強線粒體的缺血耐受性必將成為防治心肌I/R損傷的重要策略。

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