HPLC法測定葛花中鳶尾苷和鳶尾苷元的含量

趙 楠，劉 丹，王艷萍，王金鳳，魏 穎(解放軍第208醫(yī)院，吉林長春130062)

葛花是豆科植物葛根Pueraria lobata(willd.) Ohwi的干燥花蕾，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載葛花主要用于解酒醒脾，治傷酒發(fā)熱煩渴、不思飲食、嘔呃吐酸、吐血和腸風(fēng)下血等，是具有代表性的解酒藥物［1］。解酒保肝作用的成分是葛花中的異黃酮。本研究采用HPLC法可同時測定葛花中鳶尾苷和鳶尾苷元這兩種異黃酮的含量，以控制葛花藥材的質(zhì)量，國內(nèi)報道并不多見。

1 儀器與試藥

LC-10AVT高效液相色譜儀(島津);SPD-10AV檢測器(島津);HP-8452A型紫外分光光度計(美國惠普);CP225D電子天平(德國賽多利斯);葛花(河南廣安堂貿(mào)易有限公司20100225)，鳶尾苷和鳶尾苷元對照品(實驗室自制20050817，20051208，純度＞99%);水為重蒸溜水;甲醇為色譜純;其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 美國Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);甲醇-乙腈-水(2∶1∶2)為流動相，流速為1.0 ml/min;檢測波長264 nm，柱溫為室溫。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 鳶尾苷對照品:精密稱取干燥至恒重的鳶尾苷對照品5.00 mg置25 ml量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲處理10 min。用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得含鳶尾苷200.00 μg/ml的對照品溶液。

鳶尾苷元對照品:精密稱取干燥至恒重的鳶尾苷元對照品適量置25 ml量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲處理10 min。用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得含鳶尾苷元80.00 μg/ml的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 葛花藥材500 g制成粗粉，用索氏提取器提取。加85%的乙醇回流提取20 h，減壓回收乙醇，水浴干燥獲得乙醇粗提物。將粗提物用去離子水懸浮，濕法上樣于50倍量(W∶ V)的大孔樹脂AB-8柱，分別用20%、50%乙醇依次洗脫。收集50%乙醇洗脫液，減壓濃縮回收溶劑，得到葛花混合物。精密稱取葛花提取物10.60 mg于10 ml量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，精密量取2 ml置10 ml量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，超聲處理20 min，取出，放冷至室溫，濾過，取續(xù)濾液，得到供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系的考察

2.3.1 鳶尾苷 精密量取上述鳶尾苷對照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 ml置10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得7種不同濃度的鳶尾苷對照品溶液，按2.1項下色譜條件，分別進(jìn)樣25 μl，測定峰面積。以對照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=44 122X+5 039.1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，鳶尾苷在2.0～120.0 μg/ml范圍之內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 鳶尾苷元 精密量取上述鳶尾苷元對照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 ml置10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得7種不同濃度的鳶尾苷元對照品溶液，按2.1項下色譜條件，分別進(jìn)樣25 μl，測定峰面積。以對照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=61 221.3X－35 086.8，相關(guān)系數(shù)r=0.998 6，鳶尾苷元在0.8～80.0 μg/ml范圍之間線性關(guān)系良好。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 分別精密吸取鳶尾苷、苷元對照品溶液和供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別進(jìn)樣25 μl，結(jié)果表明，供試品色譜中，在與對照品圖譜相應(yīng)的位置上，有相同保留時間的色譜峰。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖A-鳶尾苷對照品;B-鳶尾苷元對照品;C-供試品;1-鳶尾苷;2-鳶尾苷元

2.4.2 精密度試驗 精密吸取同一鳶尾苷對照品濃度為20.0 μg/ml的溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次25 μl，測得鳶尾苷峰面積積分值的RSD為2.9%。精密吸取同一鳶尾苷元對照品濃度為8.0 μg/ml的溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次25 μl，測得鳶尾苷元峰面積積分值的RSD為1.4%，表示精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批次的葛花提取物適量制成供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次25 μl，測得結(jié)果苷和苷元的 RSD分別為 1.8%和1.6%，表明重復(fù)性良好。

2.4.4 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的供試品10 mg共6份，分別精密加入鳶尾苷和苷元對照品溶液適量，按上述色譜條件測定其含量，計算回收率，結(jié)果平均回收率分別為99.7%和99.4%，RSD為分別為1.9%和1.7%，具體結(jié)果見表1。

2.5 樣品含量測定 葛花藥材取5份各500 g，按照2.2.2方法提取制備，得葛花提取物5批(得率為0.1%)，按供試品溶液制備方法制備，按2.1色譜條件依法測定，結(jié)果葛花中鳶尾苷和苷元總含量平均為5 g。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

3 討論

3.1 測定波長的選擇 精密稱取一定量的鳶尾苷和鳶尾苷元對照品，用流動相溶解配制成含鳶尾苷和苷元為0.08 mg/ml的溶液，于200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，均在264 nm處有最大吸收，故選擇264 nm為鳶尾苷和苷元的測定波長。

3.2 本研究建立了同時測定葛花藥材中兩種異黃酮(鳶尾苷和苷元)含量的HPLC方法，可用于葛花藥材中此類成分的定量分析。曾對甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-水等流動相進(jìn)行考察，結(jié)果分離度都不理想，試用甲醇-乙腈-水為流動相時，分離度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05，故確定甲醇-乙腈-水為含量測定的流動相。

3.3 用HPLC法測定葛花中黃酮類成分的報道并不多，大多數(shù)以紫外分光光度測定，且測定指標(biāo)的選擇也不盡相同。張淑萍等［3］采用HPLC法測定野葛花中葛花苷、次葛花苷及尼泊爾鳶尾異黃酮含量，張國峰等［4］則以HPLC法同時測定了野葛花中葛花苷、尼泊爾鳶尾異黃酮、鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷、鷹嘴豆芽素A的含量，劉立輝等［5］采用HPLC同時測定野葛花中鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷、鳶尾苷、鳶尾苷元的含量。有報道表明［6］，存放5年以內(nèi)的葛花中幾乎檢測不到葛花苷，而主要的異黃酮成分為鳶尾苷，且葛花產(chǎn)地不同，葛花苷的含量也有明顯差別，所以選擇鳶尾苷作為測定葛花含量的主要指標(biāo)成分。本研究結(jié)果表明，葛花乙醇提取物中主要的異黃酮成分為鳶尾苷和苷元等，與其他一些相關(guān)報道一致［7］。本文所采用的方法簡便，可行，準(zhǔn)確度高，可同時測定兩種主要成分的含量，因此可用作葛花藥材質(zhì)量控制的方法。

［1］ 田代華.實用中藥辭典.下卷［M］.北京.人民衛(wèi)生出版社，2002:1338，1897.

［2］ 尹俊亭，仲 英，孫敬勇，等.葛花化學(xué)成分的研究［J］.中草藥，2006，37(3):350.

［3］ 張淑萍，賀 云，劉柏濤，等.RP-HPLC測定野葛花中3種異黃酮［J］.分析實驗室，2006，25(2):74.

［4］ 張國峰，吳 瑕，白 雪，等.HPLC法同時測定野葛花中4種異黃酮成分的含量［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2009，26(1):40.

［5］ 劉立輝，李衛(wèi)民，高 英.HPLC同時測定野葛花中鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖糖苷、鳶尾苷、鳶尾苷元的含量［J］.中國中藥雜志，2010，35(17):2308.

［6］ Kim CS，Shin SM，Ha HK，et al.Study of substance change in flowers of Pueraria thunbergiana B enth.during storage［J］.Arch Pharm Res，2003，26(3):210.

［7］ Niiho Y，Nakajima Y，Yamazaki T，et al.Simultaneous analysis of isoflavones and saponins in Pueraria flowers using hplc coupled to an evaporative light scattering detector and isolation of a new isoflavone diglucoside［J］.J Nat Med，2010，64(3):313.