人骨髓胚胎樣干細(xì)胞向多核肌纖維誘導(dǎo)分化的研究*

龐榮清， 張永云，2△， 阮光萍， 朱向情，2， 何 潔， 趙 晶， 王利民， 潘興華， 張 成

(1成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院干細(xì)胞與組織器官工程研究中心，云南昆明650032;2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，云南昆明650201;3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東廣州510080)

肌營養(yǎng)不良癥等肌病的治療目前尚無有效手段。干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展雖然為此帶來了新的希望，但療效尚需進(jìn)一步提高。其中，種子細(xì)胞的選擇是影響干細(xì)胞治療效果的關(guān)鍵因素之一［1］。

研究證實(shí):成體骨髓中存在表達(dá)胚胎干細(xì)胞抗原標(biāo)志的干細(xì)胞，如多潛能成體祖細(xì)胞(multipotential adult progenitor cells)［2］、骨髓來源成體多潛能誘導(dǎo)細(xì)胞(bone marrow－derived adult multilineage inducile cells)［3］和很小胚胎樣干細(xì)胞(very small embryonic － like stem cells，VSELs)［4］，在早期的文獻(xiàn)中這類細(xì)胞的名稱不同，近年來的文獻(xiàn)［5－7］中逐漸使用胚胎樣干細(xì)胞(embryonic－like stem cells，ELSCs)的命名。本研究根據(jù)Battula等［8］的方法，從骨髓中分離 ELSCs，然后開展了體外成肌分化實(shí)驗(yàn)研究，旨在為探索理想的肌病治療種子細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

材料和方法

1 主要試劑

成肌分化誘導(dǎo)試劑盒(SKGM－2 Kit，Lot No.CC－3245)購自 Lonza;明膠和2－mercaptoethanol購自 Sigma;DMEM/F12購自HyClone;Knockout－DMEM、血清替代物(serum replacement，SR)、glutamine、非必需氨基酸(non － essential amino acids，NEAA)、新生牛血清(newborn cattle serum，NCS)、FITC －goat－anti－rabbit IgG、FITC －rabbit－anti－goat IgG 和4＇，6－二脒基 －2－苯基吲哚(4＇，6－diamidino－2－phenylindole，DAPI)均購自Invitrogen;堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)購自 Cell Systems;免疫染色用Ⅰ抗［rabbit－anti－h(huán)uman Oct－4、Nanog－3、MyoD，goat－anti－h(huán)uman Sox－2和mouse－anti－h(huán)uman成肌素(myogenin)、肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)］購自Santa Cruz;Ⅱ抗HRP－conjugated rabbit/mouse antibody購自Gene;所用引物(表1)和RT－PCR試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

2 主要方法

2.1 ELSCs和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的分離培養(yǎng) 參照Battula等［8］的方法，密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸單個(gè)核細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到事先用明膠包被過的培養(yǎng)瓶中于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)以分離擴(kuò)增ELSCs。無血清培養(yǎng)基是添加了20%SR、2 mmol/L L － glutamine、1%NEAA、0.1 mmol/L 2 － mercaptoethanol和5 μg/L bFGF的Knockout－DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)瓶的包被:每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入5 mL 0.1%明膠溶液室溫條件下靜置30 min，然后吸棄明膠溶液于室溫條件下風(fēng)干即可。作為對(duì)照，用含血清培養(yǎng)基重懸單個(gè)核細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到未包被的培養(yǎng)瓶中于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)以分離擴(kuò)增MSCs。含血清培養(yǎng)基為含10%NCS的DMEM/F12培養(yǎng)液。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況并拍照。每4 d換液，到細(xì)胞生長至80%融合狀態(tài)時(shí)，用trypsin/EDTA消化傳代細(xì)胞。取第2代細(xì)胞作細(xì)胞爬片行Oct－4、Nanog－3和Sox－2的免疫熒光染色。

2.2 體外成肌分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 消化收集生長良好的第4代ELSCs，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，6孔板中事先放置明膠包被的蓋玻片，按照2×104cells/well接種細(xì)胞到蓋玻片上于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h使其貼壁后，吸棄無血清培養(yǎng)基，換為試劑盒提供的成肌分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。按照相應(yīng)的培養(yǎng)方案和細(xì)胞密度，消化收集生長良好的第4代MSCs，用含血清培養(yǎng)基使其貼壁生長后，吸棄含血清培養(yǎng)基，換為上述成肌分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)。適時(shí)換液，取細(xì)胞爬片，用4%多聚甲醛固定后，免疫染色檢測(cè)肌細(xì)胞抗原標(biāo)志MHC、MyoD和myogenin的表達(dá)。采用相同的方法，第4代ELSCs和MSCs培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞貼壁后，換為上述成肌分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)，消化收集細(xì)胞作RT－PCR分析。為了比較2種細(xì)胞的成肌分化效率，根據(jù)方法［9］計(jì)算樣品的成肌分化效率，每個(gè)細(xì)胞爬片計(jì)數(shù)6個(gè)視野。計(jì)算公式:成肌分化效率=MHC陽性肌纖維數(shù)/計(jì)數(shù)的總細(xì)胞數(shù)目。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法 將各組細(xì)胞用PBS清洗之后，用4%甲醛固定10 min，再用0.5%Triton X－100破膜處理10 min。然后用PBS清洗3遍，加入封閉液室溫條件下作用10 min，免疫熒光染色細(xì)胞滴加Ⅰ抗(rabbit－anti－h(huán)uman Oct－4、Nanog－3和 goat－anti－h(huán)uman Sox－2)，4 ℃避光孵育10 h，PBS漂洗1次以去除未結(jié)合的Ⅰ抗，滴加Ⅱ抗(FITC－goat－anti－rabbit IgG或 FITC－rabbit－anti－goat IgG)于室溫條件下避光孵育30 min，再滴加DAPI于室溫條件下避光孵育5 min，PBS漂洗去除未結(jié)合的Ⅱ抗和DAPI。PBS替代Ⅰ抗染色作為陰性對(duì)照。熒光顯微鏡下觀察拍照。非免疫熒光染色細(xì)胞滴加Ⅰ抗(rabbit－anti－h(huán)uman MyoD和mouse－anti－h(huán)uman myogenin、MHC)，4 ℃孵育10 h，PBS漂洗1次以去除未結(jié)合的Ⅰ抗，滴加Ⅱ抗 HRP－conjugated rabbit/mouse antibody于室溫條件下孵育30 min，PBS漂洗去除未結(jié)合的Ⅱ抗。PBS替代Ⅰ抗染色作為陰性對(duì)照。生物顯微鏡下觀察并用 ×10或 ×20攝取。每組獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)都會(huì)采集超過30個(gè)區(qū)域的細(xì)胞。

2.4 RT－PCR 采用Trizol提取總RNA，分光光度法測(cè)定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度，取5 μg RNA用于反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA。參照RT－PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)操作說明檢測(cè)myogenin、MHC和MyoD mRNA的表達(dá)。擴(kuò)增條件為:50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃ 初始化 4 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min。GAPDH用作內(nèi)參照控制。不加cDNA的反應(yīng)設(shè)為對(duì)照。取擴(kuò)增產(chǎn)物15 μL，加上樣緩沖液2.0 μL，在1%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠圖像成像系統(tǒng)拍照。

Figure 1.Morphological characterization of ELSCs and MSCs under light microscope(×40).A:primary ELSCs appeared small，morphologically slenderer and of homogeneous shape;B:primary MSCs showed different morphologies including spindle－shaped，epithelioid，polygonal or round shape.圖1 ELSCs和MSCs的形態(tài)特征

Figure 2.Expression of multipotential markers ELSCs and MSCs.A:weak expression of Oct－ 4 in ELSCs;A1:magnification of A;B:weak expression of Nanog－3 in ELSCs;B1:magnification of B;C:weak expression of Sox－2 in ELSCs;C1:magnification of C;D:no expression of Oct－4 in MSCs;E:no expression of Nanog－3 in MSCs;F:no expression of Sox － 2 in MSCs.A，B，C，D，E，F(xiàn):× 100;A1，B1，C1:×200.圖2 多潛能抗原標(biāo)志在ELSCs和MSCs的表達(dá)

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ELSCs和MSCs的分離擴(kuò)增

采用無血清培養(yǎng)基(含20%SR、2 mmol/L L－glutamine、1%NEAA、0.1 mmol/L 2 －mercaptoethanol和5 μg/L bFGF 的knockout－DMEM培養(yǎng)液)在明膠包被過的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)骨髓單個(gè)核細(xì)胞可以分離到ELSCs。采用有血清培養(yǎng)基(含10%NCS的DMEM/F12培養(yǎng)液)在未包被過的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)相同的骨髓單個(gè)核細(xì)胞可以分離到MSCs。在倒置相差顯微鏡下可見這2種細(xì)胞形態(tài)存在明顯差別。ELSCs體積較小、形態(tài)纖細(xì)均一，見圖1A。MSCs體積較大，常包括紡錘形、多邊性和圓形等多種細(xì)胞形態(tài)，見圖1B，傳代后變得均一。免疫熒光染色顯示:采用無血清培養(yǎng)基擴(kuò)增的第2代ELSCs能檢測(cè)到多潛能抗原標(biāo)志Oct－4、Nanog－3和Sox－2的微弱表達(dá)，見圖2A、A1、B、B1、C、C1，而采用經(jīng)典方法擴(kuò)增的 MSCs沒有檢測(cè)到這些抗原標(biāo)志的表達(dá)，見圖2D、E、F。

2 體外成肌誘導(dǎo)分化

由Lonza公司生產(chǎn)的成肌分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液由100 mL skeletal muscle growth medium、10 mL fetal bovine serum、2 mL glutamine、0.1 mL重組人表皮生長因子(recombinant human epidermal growth factor，rhEGF)、0.1 mL dexamethasone 和 0.1 mL gentamicin sulfate amphotericin－B組成。貼壁生長的第4代ELSCs和MSCs在此誘導(dǎo)液中培養(yǎng)3 d即可檢測(cè)到少量MHC蛋白陽性表達(dá)，10 d左右檢測(cè)到大量MHC陽性細(xì)胞，第12 d后MHC陽性細(xì)胞減少。提示:10 d是最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間。免疫染色結(jié)果顯示:誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d的第4代ELSCs和MSCs均可檢測(cè)到大量MHC和mygenin陽性的多核肌纖維，見圖3，形態(tài)特征非常典型。RT－PCR分析結(jié)果證實(shí):誘導(dǎo)10 d的ELSCs和MSCs表達(dá)了MHC和myogenin mRNA，見圖4。但沒有檢測(cè)到MyoD在蛋白和mRNA水平的表達(dá)。作為對(duì)照，不在成肌分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的ELSCs和MSCs都檢測(cè)不到肌細(xì)胞特異性標(biāo)志抗原MHC、myogenin和MyoD的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示:誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d的ELSCs的成肌分化率為(25.7±4.1)%，明顯高于MSCs(15.8±7.6)%，差異顯著(P＜0.05)。

Figure 3.Expression of muscle－specific markers in ELSCs and in MSCs cultured in myogenic differentiation medium for 10 d.A:expression of MHC in ELSCs;B:expression of MHC in MSCs;C:three nucleated fibers;D:multinucleated fibers;E:expression of myogenin in ELSCs;F:magnification of E;G:expression of myogenin in MSCs;H:magnification of G;I:no expression of MyoD in MSCs;J:no expression of MyoD in ELSCs.A，E，G，I，J:×40;B，F(xiàn)，H:×100;C，D:×400.圖3 在成肌誘導(dǎo)液中培養(yǎng)10 d的ELSCs和MSCs肌細(xì)胞特異性抗原標(biāo)志的表達(dá)

Figure 4.The RT－PCR results for mRNA expression of muscle－specific markers in ELSCs and in MSCs cultured in myogenic differentiation medium for 10 d.M:2 000 bp DNA marker;1:myogenin expression in MSCs;2:myogenin expression in ELSCs;3:negative control for myogenin;4:MHC expression in MSCs;5:MHC expression in ELSCs;6:negative control for MHC;7:no expression of MyoD in MSCs;8:no expression of MyoD in ELSCs;9:no expression of MHC in noninduced ELSCs;10:GAPDH expression in MSCs.圖4 肌細(xì)胞特異性抗原標(biāo)志基因在誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d的ELSCs和MSCs表達(dá)的RT－PCR結(jié)果

討 論

1 ELSCs的分離擴(kuò)增

Battula等［8］采用胚胎干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)方法從骨髓中分離到表達(dá)多潛能干細(xì)胞標(biāo)志的細(xì)胞，并證明這些細(xì)胞可以在體外誘導(dǎo)向脂肪、骨、胰島細(xì)胞分化。按照該方法，本研究采用無血清培養(yǎng)基(含20%SR、2 mmol/L L－glutamine、1%NEAA、0.1 mmol/L 2 － mercaptoethanol和 5 μg/L bFGF 的Knockout－DMEM培養(yǎng)液)從成體骨髓中分離到形態(tài)纖細(xì)均一的SLECs，與運(yùn)用傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基分離到的MSCs在形態(tài)上具有明顯區(qū)別，而且ELSCs微弱表達(dá)多潛能抗原標(biāo)志Oct－4、Nanog－3和 Sox－2，與 Battula等［8］的結(jié)果一致。無血清培養(yǎng)基一直是用來擴(kuò)增人胚胎干細(xì)胞的專用培養(yǎng)基，牛血清的加入將導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞的分化［10］。運(yùn)用胚胎干細(xì)胞的擴(kuò)增方法來擴(kuò)增骨髓干細(xì)胞是個(gè)很有創(chuàng)意的思路。其他學(xué)者的研究［5］也證明采用含EGF等細(xì)胞因子的無血清培養(yǎng)基可從臍血中分離到體積較小的ELSCs。這些研究均支持了成體組織中存在ELSCs的觀點(diǎn)。成體組織中存在的ELSCs，多數(shù)學(xué)者［6，11－12］認(rèn)為是胚胎發(fā)育過程中遺留下來的原始干細(xì)胞，這些干細(xì)胞因印記基因的表觀遺傳改變而處于靜息狀態(tài)，是組織器官再生的備份細(xì)胞，對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用。bFGF是維持人胚胎干細(xì)胞自我更新而不分化的強(qiáng)刺激因子［13］，也是維持造血干細(xì)胞長期保持增殖能力的重要因子［14］。本研究中ELSCs很可能就是骨髓中極少數(shù)原始干細(xì)胞擴(kuò)增的結(jié)果。

2 ELSCs的成肌誘導(dǎo)分化

5－氮雜胞苷通常用作干細(xì)胞的成肌分化誘導(dǎo)劑［15－16］，其作用機(jī)制一直被認(rèn)為是由于DNA甲基化導(dǎo)致成肌調(diào)節(jié)因子的激活［17］。由于DNA的甲基化可能導(dǎo)致細(xì)胞癌變，因此，含有5－氮雜胞苷的培養(yǎng)液并不適于干細(xì)胞誘導(dǎo)。此外，有報(bào)道顯示5－氮雜胞苷不能誘導(dǎo)人骨髓來源的MSCs分化形成肌管［9，18］。在本研究中，采用添加了rhEGF而不含有5－氮雜胞苷的成肌分化誘導(dǎo)液培養(yǎng)ELSCs和MSCs 3 d，即可將2種細(xì)胞誘導(dǎo)為多核肌纖維，細(xì)胞呈長條狀，具有多個(gè)細(xì)胞核，完全符合肌纖維的典型特征，表明不含5－氮雜胞苷的肌細(xì)胞生長培養(yǎng)液是一種安全高效的成肌分化誘導(dǎo)液。誘導(dǎo)10 d的細(xì)胞MHC表達(dá)率最高，這個(gè)結(jié)果其實(shí)反映了肌管形成的規(guī)律，即肌細(xì)胞相互融合形成多核肌管，肌管具有自發(fā)收縮功能而從培養(yǎng)瓶中脫落，因此隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間延長，免疫染色就檢測(cè)不到陽性表達(dá)的脫落細(xì)胞。有趣的是，有報(bào)道結(jié)果顯示由于rhEGF具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，因此rhEGF的存在會(huì)負(fù)調(diào)控干細(xì)胞的成肌分化［19］。很顯然，本研究中rhEGF的存在并沒有影響細(xì)胞的成肌分化，可能原因包括:(1)分離擴(kuò)增的培養(yǎng)體系不同，導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)中所用的干細(xì)胞生物學(xué)特性差異很大，其成肌分化結(jié)果自然也就不相同;(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)體系組成成分不同，誘導(dǎo)結(jié)果可能就不相同;(3)rhEGF的作用機(jī)制復(fù)雜，不同時(shí)點(diǎn)加入，單獨(dú)使用或與其它因子聯(lián)合使用的結(jié)果不同甚至相反都是可能的。我們不知道為什么在本研究中沒有檢測(cè)到MyoD的表達(dá)，一個(gè)可能的解釋就是由于rhEGF的存在影響了MyoD的表達(dá)。更重要的是在同等條件下，雖然MSCs也可被誘導(dǎo)為MHC和myogenin陽性的多核肌纖維，但ELSCs的成肌分化率顯著高于MSCs，表明ELSCs具有更強(qiáng)的成肌分化能力。ELSCs的成肌分化能力優(yōu)于MSCs的一個(gè)重要原因在于:無血清培養(yǎng)體系非常有利于骨髓中原始干細(xì)胞的增殖生長，最大程度地保持了多潛能干細(xì)胞的干性(stemness)，即最大程度地保持了其原本就有的分化潛能。而來自于相同骨髓的MSCs，含血清的培養(yǎng)體系很容易促使多潛能干細(xì)胞的分化，很大程度上丟失了原始干細(xì)胞的干性。這個(gè)研究結(jié)果還提示:應(yīng)該進(jìn)一步思考什么樣的細(xì)胞才是骨髓中的真正干細(xì)胞。最近Bhartiya等［20］提出:成體組織中真正的干細(xì)胞是VSELs這樣的多潛能干細(xì)胞(pluripotent stem cells)，MSCs和造血干細(xì)胞其實(shí)都是多潛能干細(xì)胞增殖分裂產(chǎn)生的祖干細(xì)胞(progenitor stem cells)。這里VSELs與本文中ELSCs本質(zhì)上屬于同一類細(xì)胞，只是命名不同罷了。他還認(rèn)為:過去眾多自體干細(xì)胞治療試驗(yàn)效果欠佳的重要原因就是移植的是祖干細(xì)胞，而不是具有最大再生潛能的多潛能干細(xì)胞。有的學(xué)者［12］更進(jìn)一步認(rèn)為MSCs更恰當(dāng)?shù)拿Q是間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(mesenchymal stromal cells)，因?yàn)槠渲饕饔貌皇窃偕?，而是其旁分泌機(jī)制發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)功能。盡管ELSCs與MSCs之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步深入研究，但本研究結(jié)果至少為肌營養(yǎng)不良癥等肌病的干細(xì)胞治療提供了種子細(xì)胞選擇的思路，為這些疾病的治療帶來了新的希望。

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