劉 俊 王乾華，2 周 麗，3 汪 琳＊

（1武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 武漢430071；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科 武漢430022；3河南省信陽(yáng)市中心醫(yī)院輸血科 信陽(yáng)464000）

胚胎植入，又稱著床，是囊胚經(jīng)過定位、黏著后埋入子宮內(nèi)膜的過程。胚胎植入的過程涉及一系列細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，促進(jìn)囊胚與子宮內(nèi)膜之間的相互作用，最終使胚胎成功植入［1］。一直以來，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究從不同的角度探討參與胚胎植入的關(guān)鍵分子如黏附分子、細(xì)胞因子、植入相關(guān)基因、激素［2－6］等及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中的重要作用。細(xì)胞膜是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)基礎(chǔ)，Caveolae（胞膜窖）是細(xì)胞膜上直徑為50－100nm的燒瓶狀微內(nèi)陷的膜性結(jié)構(gòu)，富含有膽固醇和鞘磷脂，多見于血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。caveolae中富含多種與信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的受體、激酶及連接蛋白。Caveolins為21kDa～25kDa完整的膜蛋白，Caveolin-1（微囊蛋白-1）是Caveolins家族成員之一，是Caveolae的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)蛋白。Caveolin-1具有異常拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，共有178個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。其中央102～134氨基酸殘基形成疏水區(qū)，在caveolae膜結(jié)構(gòu)上構(gòu)成肝素樣結(jié)構(gòu)；N－末端1～101殘基及C-末端的135～178氨基酸殘基游離并伸入胞質(zhì)內(nèi)；而N－末端的殘基82～101構(gòu)成骨架區(qū)域（scaffolding-domain），是其功能域，能結(jié)合并失活caveolae膜內(nèi)的多種信號(hào)分子，如 Ras、Raf、ERK、EGFR、eNOS［7－9］等，故caveolin-1被認(rèn)為是“廣譜”激酶抑制劑，處于各條信號(hào)通路交聯(lián)的中心。本研究通過檢測(cè)caveolin-1在圍植入期小鼠子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)，探討caveolin-1與胚胎植入的相關(guān)性。

材料和方法

1.實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物

選取健康成年雌性昆明小白鼠42只，體重23±3g，有規(guī)則的動(dòng)情周期，飼養(yǎng)于明暗周期為12h的通風(fēng)房間內(nèi)，水食自取.采用隨機(jī)分組方法將小鼠分為7組，每組按妊娠時(shí)間分為未孕組，妊娠3.5d，4.5d.5.5d，6.5d，7.5d和9d組（每組6只）.通過陰道脫落細(xì)胞圖片法確定小鼠的動(dòng)情期。后將處動(dòng)情期的雌性小鼠下午16時(shí)-17時(shí)與雄性小鼠按1∶1的比例合籠，次日早上7時(shí)-8時(shí)檢查陰道分泌物涂片，有精子者記為妊娠1d。

2.試 劑和儀器

兔抗人多克隆抗caveolin-1抗體（SantaCruze公司），S-P超敏免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒（中山公司），Total RNA Extraction Miniprep System 試劑盒（VIOGENE公司），RevertAidTM First Strand cDNA 合成試劑盒（Fermentas公司），引物合成（上海生工公司），PCR儀（BD公司）。

3.標(biāo) 本處理

將各組達(dá)到指定妊娠天數(shù)的小鼠處死，取出子宮組織，然后生理鹽水內(nèi)清洗，修剪結(jié)締組織，剪取一部分置于4%的多聚甲醛固定，石蠟切片免疫組化備用，另一部分解剖顯微鏡下分離出子宮內(nèi)膜，立即置于液氮中以備做RT-PCR。

4.免 疫組織化學(xué)步驟

標(biāo)本于4%的多聚甲醛固定24h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋后切成4μm厚的切片，經(jīng)脫蠟入水后蒸餾水洗3min×3次，PBS洗3min×3次，用枸櫞酸緩沖液進(jìn)行微波修復(fù)10min，恢復(fù)至室溫后滴加3%過氧化氫溶液室溫放置10min封閉內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗3min×3次，PBS洗3min×3次；用正常山羊血清室溫15min，封閉非特異性反應(yīng)；甩掉多余血清，滴加按1∶100比例稀釋的caveolin-1多克隆抗體（兔抗人，大鼠，小鼠），4℃過夜，PBS沖洗3min×3次；生物素標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG 37℃孵育20min，PBS洗3min×3次；滴加鏈霉抗生物素蛋白－過氧化物酶復(fù)合物37℃孵育20min，PBS沖洗3min×3次后進(jìn)行DAB顯色5～10min；沖洗后蘇木素復(fù)染1～2min；常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對(duì)照用PBS代替抗caveolin-1多克隆抗體孵育切片。采用HPIAS－2000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對(duì)caveolin-1的表達(dá)進(jìn)行定量分析，測(cè)定平均光密度值。

5.R T-PCR步驟

待每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的6只小鼠取材完以后，提取妊娠子宮組織的總RNA，通過260nm／280nm吸光度比值測(cè)定提取RNA的純度及含量。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA一鏈，PCR擴(kuò)增caveolin-1的基因片斷（引物序列參見表1）。反應(yīng)體系為50μl：10×buffer 5μl（Fermentas），10mmol／l dNTP 1μl，cDNA 5μl，Taq酶2U，引物2μl，雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)體積。反應(yīng)溫度：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，退火溫度55℃30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，采用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)及半定量分析軟件，以β-actin的表達(dá)量作為內(nèi)參進(jìn)行掃描分析mRNA條帶的平均光密度，計(jì)算caveolin-1的mRNA相對(duì)量。

表1 caveolin-1的引物序列和PCR產(chǎn)物大小Table 1 The primer order and product size of caveolin-1

6.統(tǒng) 計(jì)學(xué)分析

平均光密度和灰度掃描的結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，所有結(jié)果應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件作單因素方差分析和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

結(jié) 果

1.免 疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

Caveolin-1陽(yáng)性反應(yīng)為棕黃色，顆粒清晰，定位細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。在圍植入期子宮內(nèi)膜（蛻膜）上皮、腺體上皮、蛻膜細(xì)胞中均有陽(yáng)性表達(dá)，但表達(dá)的強(qiáng)度有差異：胚泡植入時(shí)（4.5d，5.5d，6.5d），Caveolin-1陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)最弱，而植入前（0d，3.5d），植入后（7.5d，9.5d），Caveolin-1陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)增強(qiáng)。將0d、3.5d陽(yáng)性產(chǎn)物平均光密度值計(jì)為植入前期Caveolin-1蛋白的表達(dá)水平，4.5d，5.5d，6.5d計(jì)為植入期，7.5d，9d計(jì)為植入后期，各期計(jì)算平均值，植入期組與植入前期組、植入后期組比較，差異具有顯著性（P＜0.05）；而植入前期組與植入后期組之間表達(dá)產(chǎn)物的陽(yáng)性強(qiáng)度差異無顯著性（P＞0.05）（見圖1-7，表2）。

表2 早期妊娠小鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1平均光密度的動(dòng)態(tài)表達(dá)Table 2 The average optical density of the caveolin-1protein in the mice endometria

2.子 宮內(nèi)膜組織中caveolin-1的mRNA水平的變化

通過分析caveolin-1與內(nèi)參β-actin的 mRNA條帶平均光密度比值，胚泡植入時(shí)（4.5d，5.5d，6.5d），子宮內(nèi)膜組織中Caveolin-1的mRNA水平較低；而植入前（0d，3.5d），植入后（7.5d，9.5d），子宮內(nèi)膜組織中Caveolin-1的mRNA水平較高。將0d、3.5d 計(jì)為植入 前期 Caveolin-1mRNA 表達(dá)水平，4.5d，5.5d，6.5d計(jì)為植入期，7.5d，9d計(jì)為植入后期，各期計(jì)算平均值，植入期組與植入前期組、植入后期組比較，mRNA表達(dá)水平差異具有顯著性差異（P＜0.05）；而植入前期組與植入后期組之間mRNA表達(dá)水平無顯著性差異（P＞0.05）。（見圖8，表3）。

表3 早期妊娠小鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量的變化Table 3 The relative expression of caveolin-1mRNA in the mice endomentria

討 論

哺乳動(dòng)物的胚胎植入是生殖過程的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是妊娠的關(guān)鍵。包括受精卵定向地向子宮內(nèi)遷移，與接受態(tài)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)行對(duì)話，進(jìn)而啟動(dòng)粘附、遷移、基質(zhì)降解、侵蝕母體血管及新生血管生成等信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，生理性侵襲（physiological invasion）子宮內(nèi)膜并增殖分化形成胎兒及其附屬物。正常情況下，胚胎植入是胚胎與子宮之間時(shí)空上相互協(xié)調(diào)的過程，植入的成功必須具備許多條件，涉及一系列在囊胚與子宮內(nèi)膜之間的最終使胚胎成功植入的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，這一過程的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜。

近年來關(guān)于caveolin-1的功能研究發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)caveolin-1能通過抑制凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖；通過刺激腫瘤細(xì)胞的絲狀偽足形成而促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移；促進(jìn)多藥耐受形成等［10－11］。值得注意的是，自1829年 Lobstein等提出腫瘤的胚胎性起源概念以來，早期胚胎細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的相似性研究日益受到重視。Tera等［12－14］研究證實(shí)，早期胚胎細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞以及胚胎植入與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為在病理生理過程、細(xì)胞增殖分裂、細(xì)胞凋亡、新生血管形成、免疫逃逸和侵襲性等諸多方面具有驚人的相似性。因此，本實(shí)驗(yàn)以caveolin-1為檢測(cè)對(duì)象，檢測(cè)其在圍植入期子宮內(nèi)膜組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，從而探討胚胎植入的分子機(jī)制，期許可以有助于為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理提供有意義的資料和信息。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：caveolin-1在圍植入期小鼠子宮內(nèi)膜（蛻膜）上皮、腺上皮、蛻膜血管內(nèi)皮組織中有陽(yáng)性表達(dá)，并且在植入前，植入期和植入后的表達(dá)量在蛋白水平和mRNA水平均有差異，提示子宮內(nèi)膜組織caveolin-1表達(dá)與胚胎在宮腔內(nèi)的發(fā)育相關(guān)。植入可以認(rèn)為是一種“同種異體移植的半抗原－胚胎”侵入子宮內(nèi)膜的過程，是一個(gè)受到嚴(yán)格時(shí)空調(diào)控的精密的連續(xù)性過程，因此，caveolae／caveolin-1在胚胎圍植入期不同階段可能通過表達(dá)的上升和下降以調(diào)控不同的信號(hào)通路，并進(jìn)而精確調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜的有序侵襲。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在植入前，子宮內(nèi)膜組織高水平表達(dá)caveolin-1，其意義可能在于通過對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)激酶的抑制作用，阻斷早胚植入；在植入期，子宮粘膜上皮及基質(zhì)細(xì)胞caveolin-1表達(dá)下降可能使細(xì)胞膜表面的激酶（如PTK、PKC、eNOS等）的活性部位釋放，外源信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞內(nèi)促進(jìn)內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增殖、基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化轉(zhuǎn)變、基質(zhì)內(nèi)新生血管形成等，適應(yīng)植入期滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲及快速生長(zhǎng)的需要。而在植入的后期，caveolin-1表達(dá)的上升可以抑制如PTK、PKC等通路的激活以保護(hù)作為“同種異體移植的半抗原－胚胎”細(xì)胞免受外界的影響，如機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊等，并有利于調(diào)控胚泡的適度植入。

本研究結(jié)果為尋找和確認(rèn)控制“植入窗口”形成的關(guān)鍵分子提供新思路，同時(shí)可能為臨床不孕、避孕、異位妊娠的防治和計(jì)劃生育中抗植入提供重要理論基礎(chǔ)。

［1］Paria BC，Reese J，Das SK，et al.Deciphering the cross-talk of implantation：advance and challenges.Science，2003，296（21）：2185-2188

［2］Singh H，Aplin JD.Adhesion molecules in endometrial epithelium：tissue integrity and embryo implantation.J Anat.2009，215（1）：3-13

［3］Chung D，Gao F，Ostmann A，et al.Nucleolar Sik-similar protein（Sik-SP）is required for the maintenance of uterine estrogen signaling mechanism via ERα.Mol Endocrinol.2012，26（3）：385-398

［4］Luan L，Ding T，Stinnett A，et al.Adherens junction proteins in the hamster uterus：their contributions to the success of implantation.Biol Reprod.2011，85（5）：996-1004

［5］Yshino O，Osuga Y，Hirota Y，et al.Endometrial stromal cells undergoing decidualization down-regulate their properties to produce proinflammatory cytokines in response to interleukin-1beta via reduced p38mitogen-actived protein kinase phosphorylation.J Clin Endocrinol Metab，2003，88（5）：2236-2241

［6］Otun HA，Lash GE，Innes BA，et al.Effect of tumour necrosis factor-αin combination with interferon-γon first trimester extravillous trophoblast invasion.J Reprod Immunol.2011，88（1）：1-11

［7］Lim EJ，Smart EJ，Toborek M，et al.The role of caveolin-1in PCB77-induced eNOS phosphorylation in human-derived endothelial cells.Am J Physiol Heart Circ Physiol.2007，293（6）：H3340-3347

［8］Penumathsa SV，Thirunavukkarasu M，Zhan L，et al.Resveratrol enhances GLUT-4translocation to the caveolar lipid raft fractions through AMPK／Akt／eNOS signalling pathway in diabetic myocardium.J Cell Mol Med.2008Dec；12（6A）：2350-2361

［9］Carver LA，Schnitzer JE.Caveolae：mining little caves for new cancer targets.Nat Rev Cancer，2003，3（8）：571-581

［10］Boscher C，Nabi IR.Caveolin-1：role in cell signaling.Adv Exp Med Biol.2012，729：29-50

［11］Williams TM，Lisanti MP.Caveolin-1in oncogenic transformation，cancer，and metastasis.Am J Physiol Cell Physiol.2005，288（3）：494-506

［12］Zou H，Volonte D，Galbiati F.Interaction of caveolin-1with Ku70inhibits Bax-mediated apoptosis.PLoS One.2012，7（6）：e39379

［13］Terao Y，Kumano S，Takatsu Y，et al.Biochim Bio-phys Acta.Expression of KiSS-1，a metastasis suppressor gene，in trophoblast giant cells of the rat placenta.2004，1678（2-3）：102-110.

［14］Duong T，Proulx ST，Luciani P，et al.Genetic ablation of SOX18function suppresses tumor lymphangiogenesis and metastasis of melanoma in mice.Cancer Res.2012，72（12）：3105-3114

圖 版 說 明

圖1 妊娠0d組小鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1的表達(dá)（↑示子宮內(nèi)膜）免疫組化SP法 ×200

圖2 妊娠3.5d組小鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1的表達(dá)（↑示子宮內(nèi)膜）免疫組化SP法 ×200

圖3 妊娠4.5d組小鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1的表達(dá)（↑示子宮內(nèi)膜）免疫組化SP法 ×200

圖4 妊娠5.5d組小鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1的表達(dá)（↑示蛻膜）免疫組化SP法 ×200

圖5 妊娠6.5d組小鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1的表達(dá)（↑示蛻膜）免疫組化SP法 ×200

圖6 妊娠7.5d組小鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1的表達(dá)（↑示蛻膜）免疫組化SP法 ×200

圖7 妊娠9d組小鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1的表達(dá)（↑示蛻膜）免疫組化SP法 ×200

圖8 子宮內(nèi)膜組織caveolin-1mRNA表達(dá)水平

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1The expression of caveolin-1in mouse endometria on 0 day of pregnancy（↑endometria）Immunohistochemical stainning（SP）×200

Fig.2The expression of caveolin-1in mouse endometria on 3.5day of pregnancy（↑endometria）Immunohistochemical stainning（SP）×200

Fig.3The expression of caveolin-1in mouse endometria on 4.5day of pregnancy（↑endometria）Immunohistochemical stainning（SP）×200

Fig.4The expression of caveolin-1in mouse endometria on 5.5day of pregnancy（↑decidua）Immunohistochemical stainning（SP）×200

Fig.5The expression of caveolin-1in mouse endometria on 6.5day of pregnancy（↑decidua）Immunohistochemical stainning（SP）×200

Fig.6The expression of caveolin-1in mouse endometria on 7.5day of pregnancy（↑decidua）Immunohistochemical stainning（SP）×200

Fig.7The expression of caveolin-1in mouse endometria on 9 day of pregnancy.（↑decidua）Immunohistochemical stainning（SP）×200

Fig.8The expression of caveolin-1mRNA in the mice endometria