6羥基多巴誘導(dǎo)的帕金森細(xì)胞模型中Hsp60的定位表達(dá)研究

張靈 馮美江

帕金森病(PD)是老年人最常見的疾病之一。PD是一種慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元減少為其主要病理特征。隨著對PD發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，人們越來越認(rèn)識到以小膠質(zhì)細(xì)胞活化為主的免疫炎癥在PD發(fā)生及發(fā)展中的重要作用［1］。此外，近年來的研究表明，心肌梗死和神經(jīng)系統(tǒng)損傷后熱休克蛋白60(Hsp60)可從細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外，通過免疫炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重神經(jīng)損傷［2］。本研究將初步探討Hsp60在6羥基多巴(6-OHDA)誘導(dǎo)的帕金森細(xì)胞模型中的定位表達(dá)變化及其可能意義。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器PC12(腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系)細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。6-OHDA、維生素C(VitC)、二甲基亞砜(DMSO)、DMEM高糖培養(yǎng)基(達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基)、胰蛋白酶購自Sigma公司。胎牛血清購自Gibco公司，抗-Hsp60抗體購自Santa Cruz公司。熒光二抗、煙酸己可堿(Hoechst，用以染核)、Bio二抗購自Jackson公司。熒光倒置顯微鏡為Leica公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%的胎牛血清、100 μg/ml青霉素/鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液。待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后，用0.25%的胰蛋白酶消化后，以2×105/ml密度接種于底面積25 cm2的培養(yǎng)瓶(15 ml/瓶)。

1.2.2 免疫印記(Western Blot)檢測：孵育24 h后，實驗組和對照組分別加入含0.2%VitC的6-OHDA溶液(終濃度為100 μmol/L)和0.2%VitC溶液(終濃度為0.002%)，分別繼續(xù)孵育3 h、6 h、12 h、24 h、48 h后吸去培養(yǎng)液，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，經(jīng)與抗-Hsp60抗體(稀釋濃度為1∶500)和相應(yīng)的二抗(稀釋濃度為1∶1000)孵育，再用ECL試劑盒顯示蛋白。各時間點(diǎn)收取的培養(yǎng)液上清離心后同上步驟孵育完一抗，后加生物素二抗放大，用ECL試劑盒顯示蛋白。

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光：將PC12細(xì)胞接種到放有小圓片的24孔板，孵育24 h后，實驗組和正常對照組分別加入含0.2%VitC的6-OHDA溶液(終濃度為100 μmol/L)和0.2%VitC溶液(終濃度為0.002%)，分別繼續(xù)孵育3 h、6 h、12 h、24 h、48 h后吸去培養(yǎng)液，細(xì)胞多聚甲醛固定，10%驢血清封閉后與抗-Hsp60抗體(稀釋濃度為1∶100)和相應(yīng)的二抗(稀釋濃度為1∶1000)及Hoechst(稀釋濃度為1∶800)孵育，用熒光倒置顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各實驗組間比較用單因素方差分析(one way ANOVA)，每組數(shù)據(jù)來自至少3次重復(fù)實驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PC12細(xì)胞蛋白表達(dá)變化隨著6-OHDA作用時間延長，Hsp60在PC12細(xì)胞中的表達(dá)呈現(xiàn)降低的趨勢，24 h和48 h時間點(diǎn)的蛋白表達(dá)與正常對照組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 Hsp60在PC12細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.2 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果細(xì)胞免疫熒光顯示，Hsp60在正常PC12細(xì)胞的胞漿中表達(dá)，模型組的PC12在6-OHDA作用下胞體逐漸變小、皺縮，胞核不均勻高亮染色。Hsp60表達(dá)信號成環(huán)形并且相對于正常對照組有明顯減少趨勢，這與細(xì)胞蛋白的表達(dá)結(jié)果一致，見圖2。

圖2 細(xì)胞免疫熒光檢測Hsp60在PC12細(xì)胞胞漿中表達(dá)水平

2.3 培養(yǎng)上清液中Hsp60表達(dá)變化Hsp60在正常對照組的培養(yǎng)上清液中檢測不到表達(dá)信號，而在模型組則可明確檢測到表達(dá)信號，并且隨著時間延長呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，24 h和48 h時間點(diǎn)的Hsp60表達(dá)與3 h時間點(diǎn)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

圖3 培養(yǎng)上清液中Hsp60蛋白表達(dá)水平

3 討論

PD是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性病，在≥65歲的人群中發(fā)病率約為1.7%。PD主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動遲緩、姿勢步態(tài)異常等，嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量。但因PD發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前臨床上針對該病主要是對癥治療［3-4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PD黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的減少往往伴隨著小膠質(zhì)細(xì)胞的持續(xù)活化［5］。多巴胺能神經(jīng)元損傷可釋放損傷因子，某些損傷因子在胞外可以與小膠質(zhì)細(xì)胞表面受體結(jié)合從而活化小膠質(zhì)細(xì)胞。目前認(rèn)為，以小膠質(zhì)細(xì)胞活化為主要特征的免疫炎癥反應(yīng)在PD的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮至關(guān)重要的作用［6-7］。

熱休克蛋白(Hsps)是一種應(yīng)激蛋白，Hsp60是Hsps家族中的重要一員。最初研究認(rèn)為，Hsp60作為線粒體蛋白主要表達(dá)在胞漿［8］。近年來，Hsp60的細(xì)胞外作用已引起高度重視并成為研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，心衰時Hsp60可轉(zhuǎn)位到胞膜［9］，細(xì)胞外的Hsp60可通過活化Toll樣受體4(TLR-4)介導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡［10］。Hsp60還可被瀕死細(xì)胞和壞死細(xì)胞釋放到胞外，作為損傷信號發(fā)揮胞外作用［11］。腫瘤細(xì)胞也可分泌Hsp60從而發(fā)揮胞外作用［12］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，損傷的神經(jīng)元可釋放Hsp60到胞外，細(xì)胞外的Hsp60可通過TLR-4-Myd88信號通路活化小膠質(zhì)細(xì)胞［2］，從而引發(fā)免疫炎癥反應(yīng)。在PD，小膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)過度活化可產(chǎn)生大量炎癥因子，如TNF-α、IL-1、IL-6和iNOS［13-15］。這些炎癥因子可能通過氧化應(yīng)激和引發(fā)凋亡級聯(lián)反應(yīng)進(jìn)一步加重神經(jīng)元的損害［16］。

本研究表明，6-OHDA作用24 h和48 h后，PC12細(xì)胞內(nèi)Hsp60的表達(dá)與正常對照組相比明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而培養(yǎng)上清液中可明確檢測到Hsp60表達(dá)，且隨時間延長而表達(dá)逐漸增多。我們的研究結(jié)果有力地證實了Hsp60在PD細(xì)胞模型中可被釋放到胞外。我們推測，釋放到細(xì)胞外的Hsp60可能通過某種機(jī)制參與活化小膠質(zhì)細(xì)胞并導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)一步損傷，從而參與PD的發(fā)生與發(fā)展。

［1］Amor S，Puentes F，Baker D，et al.Inflammation in neurodegenerative diseases［J］.Immunology，2010，129(2)：154-169.

［2］Lehnardt S，Schott E，Trimbuch T，et al.A vicious cycle involving release of heat shock protein 60 from injured cells and activation of Toll-like receptor 4 mediates neurodegeneration in the CNS［J］.J Neurosci，2008，28(10)：2320-2331.

［3］黃東明，覃少東，楊華丹.普拉克索聯(lián)合美多巴治療老年中晚期帕金森病的臨床研究［J］.實用老年醫(yī)學(xué)，2011，25(6)：490-495.

［4］華智強(qiáng).普拉克索治療帕金森病非運(yùn)動癥狀的療效觀察［J］.實用老年醫(yī)學(xué)，2010，24(6)：498-500.

［5］Yenari MA，Kauppinen TM，Swanson RA.Microglial activation in stroke：therapeutic targets［J］.Neurotherapeutics，2010，7(4)：378-391.

［6］Melinda E，Michelle L.Microglial activation and chronic neurodegeneration［J］.Neurotherapeutics，2010，7(4)：354-365.

［7］張艷玲，蘇炳銀.帕金森病發(fā)病免疫機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.實用老年醫(yī)學(xué)，2009，23(2)：150-152.

［8］Martin JE，Swash M，Mather K，et al.Expression of the human groEL stress-protein homologue in the brain and spinal cord［J］.J Neurol Sci，1993，118(2)：202-206.

［9］Lin L，Kim SC，Wang Y，et al.HSP60 in heart failure：abnormal distribution and role in cardiac myocyte apoptosis［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293：H2238-H2247.

［10］Kim SC，Stice JP，Chen L，et al.Extracellular heat shock protein 60，cardiac myocytes and apoptosis［J］.Circ Res，2009，105(12)：1186-1195.

［11］Saito K，Dai Y，Ohtsuka K，et al.Enhanced expression of heat shock proteins in gradually dying cells and their release from necrotically dead cells［J］.Exp Cell Res，2005，310(1)：229-236.

［12］Merendino AM，Bucchieri F，Campanella C，et al.Hsp60 is actively secreted by human tumor cells［J］.PLoS ONE，2010，5(2)：e9247.

［13］Mogi M，Harada M，Riederer P，et al.Tumor necrosis factor-alpha(TNF-alpha)increases both in the brain and in the cerebrospinal fluid from Parkinsonian patients［J］.Neurosci Lett，1994，165(1/2)：208-210.

［14］Blum-Degen D，Müller T，Kuhn W，et al.Interleukin-1 beta and interleukin-6 are elevated in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's and de novo Parkinson's disease patients［J］.Neurosci Lett，1995，202(1/2)：17-20.

［15］Knott C，Stern G，Wilkin GP.Inflammatory regulators in Parkinson's disease：iNOS，lipocortin-1，and cyclooxygenases-1 and-2［J］.Mol Cell Neurosci，2000，16(6)：724-739.

［16］De Lella Ezcurra AL，Chertoff M，F(xiàn)errari C，et al.Chronic expression of low levels of tumor necrosis factor-alpha in the substantia nigra elicits progressive neurodegeneration，delayed motor symptoms and microglia/macrophage activation［J］.Neurobiol Dis，2010，37(3)：630-640.