姜黃素體外抑制淋球菌活性的研究

夏承來 黃漢輝 何之廣

廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院藥劑科，廣東廣州 510150

性傳播疾病，是以性接觸為主要傳播方式的一組疾病。國際上將20多種通過性行為或類似性行為引起的感染性疾病列入生殖感染范疇。淋病是目前世界上發(fā)病人數(shù)最多的生殖器感染之一，由淋球菌引起，男性較女性多見。得淋病后，主要癥狀是尿道炎，尿道口紅腫、流膿、有刺痛、灼熱感，排尿困難，小便次數(shù)多。若不及時(shí)治療會(huì)轉(zhuǎn)成慢性尿道炎。目前防治淋病的主要方法有：使用避孕套、減少性伴以及運(yùn)用抗菌素治療生殖道感染[1]。由于細(xì)菌對青霉素類藥物的耐藥性不斷增加，開發(fā)新的抗淋球菌藥物已經(jīng)迫在眉睫。

姜黃為姜科姜黃屬的多年生草本植物，根莖發(fā)達(dá)，成叢，分枝呈橢圓形或圓柱狀，具有良好的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)前景。從其根莖中提取的活性成分主要為姜黃素。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗氧化、抗炎、抑癌作用以及對多種蛋白激酶有抑制活性[2]。且有研究表明，在淋球菌導(dǎo)致的機(jī)體炎癥反應(yīng)中，姜黃素可以阻斷NF-kappaB信號通路來抑制TNF-α、IL-6和IL-8等炎性因子的釋放[3]。但是目前并無姜黃素直接抑制淋球菌的生長的報(bào)道。為此本資料中主要研究了姜黃素體外抑制淋球菌的活性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞和淋球菌菌株來源

原代培養(yǎng)的包皮角朊細(xì)胞購自武漢非典型物收藏中心。從臨床標(biāo)本中分離獲得淋球菌菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)染色、氧化酶試驗(yàn)、生長鑒定和糖發(fā)酵試驗(yàn)鑒定。用接種環(huán)挑取培養(yǎng)18 h的新鮮菌液，洗于含無菌生理鹽水2 mL的小試管中，調(diào)整細(xì)菌數(shù)至2 MacFarland單位（4×108/mL）。

1.2 姜黃素細(xì)胞毒性的測定[4]

姜黃，市售。姜黃素的提取工藝條件: 將姜黃置于6倍其量的70%乙醇溶液中，回流提取3次，每次1.5 h。

3,3’-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉（XTT）購自sigma公司。XTT檢測方法：（1）XTT儲(chǔ)存液的配置：用PBS將3,3-bis[1-methoxy-3,4-nitro-5-sulophenyl]-2-[4-(phenylamino) carbonyl]-6-tetrazolimhydroxide（XTT）配成1 mg/mL；（2）聚α-甲基苯乙烯（PMS）儲(chǔ)存液的配置（100 X）：用磷酸緩沖液（phosphate belanced solution，PBS）將 N-methylphenazonium methosulfate（PMS，MW=306.3）配成2 mM（0.612 mg/mL），分裝后保存在-20℃條件下；（3）XTT工作液的配置：將100μL PMS儲(chǔ)存液（100X）和9.9 m L XTT儲(chǔ)存液混合而成，PMS的終濃度為0.02 mM；（4）加入50μL XTT/PMS工作液，37℃孵育4 h后用多功能酶標(biāo)儀檢測OD450的吸光值并計(jì)算細(xì)胞毒性率和CC50值。

1.3 姜黃素抑菌圈的測定[5]

采用平板（打孔法），待MHSM平板干后，用無菌棉簽蘸取菌液，在培養(yǎng)基平板上密集畫線接種。蓋好平皿，放置5 min，待平板表面水分吸收后，用直徑6 mm無菌金屬打孔器在平皿內(nèi)打孔，除去洞內(nèi)瓊脂，用微量移液器吸取50μL不同濃度的藥液，依次加入洞內(nèi)，37℃培養(yǎng)16~18 h，記錄抑菌圈的直徑，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，3次平均值為化合物的抑菌直徑。

1.4 姜黃素最低抑菌濃度（M inimal inhibitory concentration，M IC）的測定

根據(jù)文獻(xiàn)[5]，采用平板稀釋法，于直徑9 cm滅菌培養(yǎng)皿中分別加入無菌溶劑配成的不同濃度姜黃素（200 mg/mL，100 mg/mL，50 mg/m L，25 mg/mL，12.5 mg/m L，6.25 mg/m L，3.13 mg/mL 和0 mg/mL）1 mL，然后注入已經(jīng)融化的冷卻至45℃的淋球菌瓊脂培養(yǎng)液9 m L，立即旋轉(zhuǎn)混勻，凝固。用接種環(huán)挑取一滿環(huán)菌液，劃線接種于平板上，同時(shí)在不含藥液的平板上，接種相同量的菌液為對照，置于置淋球菌最佳培養(yǎng)溫度條件下培養(yǎng)1個(gè)周期，于培養(yǎng)皿中分觀察并記錄菌落數(shù)。其中每個(gè)濃度做 3個(gè)平行皿，以無菌生理鹽水為空白對照。以不長菌的藥物最高稀釋度為該化合物對淋球菌的最低抑菌濃度（實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次或2次相同者為報(bào)告數(shù)據(jù)）。

表1 姜黃素對淋球菌的抑菌作用 (37℃培養(yǎng)24 h )

表2 姜黃素對淋球菌的最低抑菌濃度（37 ℃培養(yǎng)24 h）

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對原代培養(yǎng)的包皮角朊細(xì)胞的細(xì)胞毒性

96孔板每孔鋪原代培養(yǎng)的包皮角朊細(xì)胞（每孔細(xì)胞濃度為10 000個(gè)/m L）和不同濃度的姜黃素（400 mg/m L，200 mg/mL， 100 mg/mL，50 mg/m L，25 mg/m L 和 0 mg/m L）37℃孵育過夜；去除150 μL培養(yǎng)基后再加入150 μL新鮮培養(yǎng)基，再于37℃孵育72 h；加入50μL XTT/PMS工作液，37℃孵育4 h后用多功能酶標(biāo)儀檢測OD450的吸光值并計(jì)算CC50值。姜黃素對原代培養(yǎng)的包皮角朊細(xì)胞的細(xì)胞毒性的CC50值＞（400.00±1.16）mg/mL。見圖 1。

圖1 姜黃素對原代培養(yǎng)的包皮角朊細(xì)胞的細(xì)胞毒性

2.2 姜黃素對淋球菌的抑菌圈

200 mg/mL的姜黃素對淋球菌有抑菌圈產(chǎn)生，說明其對淋球菌有明顯抑殺作用，與最小抑菌濃度試驗(yàn)結(jié)果亦相符?？紤]到紙片直徑為5.0 mm，因此認(rèn)為抑菌環(huán)直徑＞7.0 mm時(shí)，姜黃素有抑菌作用；抑菌圈≤7.0 mm時(shí)，姜黃素?zé)o抑菌作用。見表1。

2.3 姜黃素最低抑菌濃度

用菌體生長面積占平板面積的百分比來表示姜黃素對淋球菌的抑菌作用。當(dāng)姜黃素濃度低于100 mg/mL時(shí)，菌體生長面積占平板面積的百分比逐漸增加，說明低于100 mg/mL的姜黃素對淋球菌不再具有完全抑制作用。因此，姜黃素必須達(dá)到一定濃度后對淋球菌有抑制作用，其最小抑菌濃度是100 mg/mL。見表2。

3 討論

20世紀(jì)40年代中期，青霉素成為治療淋病的首選藥物。隨著青霉素的廣泛應(yīng)用，淋球菌對青霉素出現(xiàn)低水平耐藥，此后耐藥程度漸增[6]。淋球菌耐藥菌株在某一地區(qū)產(chǎn)生后，可迅速在局部、一個(gè)國家內(nèi)及不同國家間傳播。美國疾病控制中心在《性傳播疾病治療指南》中不再推薦青霉素與四環(huán)素作為治療淋病的首選藥物。最近的全球淋球菌耐藥監(jiān)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)[7-8]，淋球菌對氟喹諾酮類藥物、第三代頭孢菌素的敏感性也出現(xiàn)下降或耐藥，淋球菌耐藥已成為當(dāng)前淋病防治中棘手的問題。我國淋球菌耐藥監(jiān)測資料表明，淋球菌對青霉素和四環(huán)素耐藥較為普遍，許多城市和地區(qū)檢出產(chǎn)青霉素酶淋球菌，其中檢出陽性率以成都、重慶為高，上海和南京地區(qū)耐藥菌檢出率也呈上升趨勢，青霉素和四環(huán)素已不宜用于治療淋病。因此，尋找新的抗淋球菌藥物已經(jīng)刻不容緩。并且隨著社會(huì)的發(fā)展，人們越來越關(guān)注化學(xué)藥品給人類自身健康及生活環(huán)境帶來的負(fù)面影響；回歸自然、保護(hù)環(huán)境已成為一種處理人類和環(huán)境關(guān)系的潮流思想。近年來，由于天然藥物在治療上的獨(dú)特優(yōu)勢（來自大自然，毒副作用小，在治療艾滋病等疑難雜癥上有廣闊的前景）而倍受重視[9-10]。

因此本資料關(guān)注了來源于姜黃的提取物姜黃素的抗淋球菌的活性，結(jié)果表明，200 mg/mL的姜黃素對淋球菌有抑菌圈產(chǎn)生，抑菌圈的直徑是（14.3±1.3）mm；同時(shí)，姜黃素達(dá)到一定濃度后對淋球菌有抑制作用，其最小抑菌濃度是100 mg/mL，說明姜黃素能夠抑制淋球菌的生長。但是姜黃素是否可以開發(fā)成新的抗淋球菌藥物用于臨床研究，還需要大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

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