江青東

（鄭州牧業(yè)高等?？茖W(xué)校動物醫(yī)學(xué)系，河南 鄭州 450011）

5－羥色胺（5-HT）是一種吲哚衍生物，分子式C10H12N2O。5-HT能與酸作用生成結(jié)晶鹽，其熔點167℃～168℃。5-HT是調(diào)節(jié)神經(jīng)活動的一種重要物質(zhì)［1－4］。美國辛辛那提大學(xué)醫(yī)學(xué)院納爾遜·霍斯曼等人研究發(fā)現(xiàn)，5-羥色胺能降低奶牛的產(chǎn)奶量。只要抑制奶牛乳腺中的5-HT含量，就可以將產(chǎn)奶量提高15%，這些作用可被5-HTR拮抗劑二甲麥角新 堿 阻 斷，提 示是經(jīng)過 5-HTR 產(chǎn) 生 的［5－7］。目前，針對哺乳動物5-HTR 基因在乳腺組織中的分布尚未報道。

本試驗通過牛和鼠在其他組織中的5-HTR4基因序列設(shè)計同源性引物采用RT-PCR方法克隆出奶山羊乳腺組織中5-HTR4的基因組全序列，這將對下一步研究特異性針對乳腺中的5-HTR4，通過基因敲除技術(shù)，是一種綠色環(huán)保藥物，來提高哺乳動物的產(chǎn)奶量和養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 取泌乳期奶山羊（購自陜西薩能奶山羊養(yǎng)殖基地）乳腺組織，液氮速凍后保存于－80℃。

1.2 菌株和質(zhì)粒 p MD19-T 載體、E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒p GEX-4T-1，均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司，E.coliBL21（Promega公司）。

1.3 試劑 AMV反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、動物 組 織 RNAout、RNase-Inhibitor、Oligo（d T）、Ta KaRa Agarose Gel、DNA Purification Kit Ver.2.0、DNA Marker、TaqDNA聚合酶、TaKaRa保存待測。BamHⅠ、XhoⅠ和IPTG，均購自Ta KaRa寶生物工程（大連）有限公司，T4 DNA連接酶（Promega公司）；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)Marker（Sigma公司）。

1.4 克隆與序列分析

1.4.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank公布的牛和鼠的5-HTR4基因的cDNA序列，利用Primer 5.0引物設(shè)計軟件和BLAST鑒定設(shè)計克隆引物。上游：5′-GTGGAGAAGGTSGTGCTGCTCACG -3′，下 游：5′-GGTTGTGGTTGAACARGGGACAGTCTG-

3′，預(yù)期片段1 293 bp，引物由北京三博遠(yuǎn)志生物科學(xué)技術(shù)有限公司合成。

1.4.2 RNA的提取 按照動物組織RNAout試劑盒的說明進行提取乳腺組織總RNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳（130 V，15 min），紫外燈下觀察。紫外分光光度計測定OD260和OD280，檢測RNA的純度及含量（圖1）。

圖1 乳腺組織中總RNA電泳結(jié)果

1.4.3 RT-PCR擴增體系 RT體系：模板 RNA 2 μL，5×Buffer 4μL，d NTP Mix 4μL，RNase Inhibitor 0.5μL，Oligo（d T）1μL，AMV 0.5μL，DEPCH2O 6μL，總體積20μL。混勻室溫放置10 min，42℃1 h，置－20℃冰箱備用。PCR擴增體系：10×Buffer（Mg2＋）5μL，d NTP Mix 6μL，25 mmol／L MgCl26μL，rTaq0.5μL，上、下游引物各1μL，cDNA 4μL，dd H2O 14μL，總體積50μL。PCR反應(yīng)程序：95℃變性5 min；95℃10 s，52℃20 s，72℃30 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取5μL PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠（100 V、30 min）電泳。凝膠照像并檢測PCR產(chǎn)物積分光密度值，用各基因與β-actin的比值相對定量轉(zhuǎn)錄水平。

1.4.4 PCR產(chǎn)物回收 產(chǎn)物回收根據(jù) UNIQ-10膠回收試劑盒說明書進行。

1.4.5 目的基因的克隆與測序 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，堿裂解法提取重組質(zhì)粒DNA，通過酶切和PCR鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果；陽性菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司測序。

1.4.6 序列分析 通過 Blast、Smart及 BioXM2.6和DNAStar軟件對序列進行分析。

1.5 原核表達(dá)載體p GEX-5-HTR4的構(gòu)建

1.5.1 引物 根據(jù)克隆的序列設(shè)計一對表達(dá)引物，上游：5′-CGCCCATCGTCGCATCGCATCG-3′，下游：5′-CCGCGTGAGATCACGCTCTCATG-3′，并在引物中引入BamHⅠ／XhoⅠ酶切位點（劃線）。

1.5.2 PCR 擴增體系 dd H2O 15.3μL，10×Buffer（Mg2＋）2.5μL，d NTP Mix 3μL，25 mmol／L MgCl21.8μL，P1、P2 各 0.5μL，克隆載體p MD19-T-5-HTR4 1μL，rTaq0.4μL，總體積25 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，59.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化按照純化試劑盒說明書進行。

1.5.3 質(zhì)粒pGEX-4T-1和純化后的 PCR產(chǎn)物進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切 純化回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶進行連接，22℃3 h，然后轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜。提取重組質(zhì)粒，并進行PCR和雙酶切鑒定，測序由北京三博遠(yuǎn)志生物科學(xué)技術(shù)有限公司完成。并將重組質(zhì)粒命名為p GEX-5-HTR4。

1.6 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定 將含重組質(zhì)粒（pGEX-5-HTR1）的E.coli單 菌 落 和 含 空 載 體（pGEX-4T-1）E.coli單菌落分別接種于含有氨芐青霉素的2×YT液體培養(yǎng)基，于37℃搖震培養(yǎng)過夜。然后將培養(yǎng)物按1∶100的比例接種于新鮮的含有氨芐青霉素的2×YT液體培養(yǎng)基，37℃搖震培養(yǎng)至A600＝0.5～0.6時，加入IPTG 35℃誘導(dǎo)9 h，每2 h取出1 m L培養(yǎng)物。離心收集菌體，用20μL PBS重懸菌體，并加入20μL 2×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，100℃變性10 min，進行SDS-PAGE，分析目的蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆與序列分析

2.1.1 奶山羊5-HTR4基因的克隆序列 克隆奶山羊5-HTR4基因包含一個完整的開放閱讀框架（ORF），長為1 293 bp，酸性氨基酸42個，堿性氨基酸81個，蛋白質(zhì)分子量為：44.89 k Da，等電點：11.972。

2.1.2 奶山羊5-HTR4基因的種屬差異分析

DNAStar分析發(fā)現(xiàn)，奶山羊5-HTR4基因的ORF與兔 （Z50162）、豬 （NM-001173418）、人 （human-5HT1D）、狗（NM-001003280）和鼠（AK082016）的同源性分別為46.1%、47.2%、78.9%、45.8%及89.8%。Blastp序列比較分析，奶山羊5-HTR4基因氨基酸序列與鼠和人的同源性分別為88%和77%，相似性分別為83%和79%；Smart分析發(fā)現(xiàn)，奶山羊5-HTR4基因推測氨基酸序列信號肽與人、鼠5-HTR4基因氨基酸序列信號肽均為1～23aa，Sap B結(jié)構(gòu)域均為49～126aa，結(jié)構(gòu)特征與人、鼠的5-HTR4相一致。

2.2 原核表達(dá)載體的鑒定與誘導(dǎo)表達(dá)

2.2.1 原核表達(dá)載體p GEX-5-HTR2的鑒定 以克隆的序列設(shè)計表達(dá)引物進行PCR，得到了長度約為1 293 bp的目的片段；重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切鑒定，切出約4 700 bp和1 293 bp的DNA片段，與理論值相符（圖2）。

2.2.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) p GEX-5-HTR4轉(zhuǎn)化的菌株，在約44.89 k Da處出現(xiàn)一條新生蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，而pGEX 4T-1轉(zhuǎn)化的菌株則只在44.89 k Da處有一新生條帶，說明5-HTR4基因已在大腸桿菌中成功表達(dá)，并與GST形成融合蛋白（圖3）。

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果

2.2.3 表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析 重組表達(dá)載體p GEX-5-HTR1宿主菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，離心沉淀，用化學(xué)和超聲方法裂解細(xì)菌后，SDS-PAGE凝膠電泳分析，蛋白主要以不溶性包涵體形式存在。

3 討論

5-HT分布全身，尤其在血小板和腸內(nèi)更多，腦內(nèi)主要是在中縫核及延腦中。迄今為止已發(fā)現(xiàn)人類5-HTR至少有7大類，這7種類型又可進一步分成若干亞型［8－11］。按照受體轉(zhuǎn)導(dǎo)方式的不同，可分為G蛋白偶聯(lián)體超家族和配體門控離子通道族兩大類。5-HTR4主要分布于基底節(jié)及新皮層區(qū)，周圍組織血管及神經(jīng)節(jié)中也有分布［12］。目前5-HTR激動劑和抑制劑都是用于神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，治療精神疾?。?3］。況且沒有專門針對5-HTR的藥物，將這些化學(xué)藥物用于奶牛，一是會影響奶牛的健康，最重要的是這些化合物會在奶里殘留，進而影響人的健康。

圖3 重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析

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