趙 德，喬 翠，張 強，郭建宏，高鳳山，＊

（1.大連大學生命科學與技術學院分子免疫學實驗室，遼寧大連 116622；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原微生物國家重點實驗室 ，甘肅蘭州 730046）

人類歷史上，疫苗的發(fā)展史可以分為3個階段：古典疫苗時期，即在病原體發(fā)現(xiàn)前據(jù)反復觀察和摸索經(jīng)驗而研制出疫苗的時期，例如英國鄉(xiāng)村醫(yī)生Jenner用牛痘接種到人體上，使人獲得免疫能力；傳統(tǒng)疫苗時期，即利用病變組織、人工培養(yǎng)的病原微生物制備滅活疫苗和減毒疫苗的時期；基因工程疫苗時期，即采用DNA重組技術生產(chǎn)疫苗的時期。傳統(tǒng)疫苗可分為減毒活疫苗和滅活疫苗。傳統(tǒng)疫苗最大的優(yōu)點就是免疫力強、保護性好，減毒活疫苗缺點是存在毒力恢復、散毒或基因重組等潛在的生物危害。

當病原微生物入侵機體，給機體造成傷害的同時，也會引發(fā)免疫反應。疫苗免疫的基本原理就是利用既能激起免疫應答反應，又不會造成傷害的生物制劑，使機體獲得相應的免疫能力，免疫應答反應并非針對整個外源物質(zhì)，而僅僅是針對表位，通常是一段多肽。表位疫苗是近年來發(fā)展起來的一種新型疫苗，它是利用基因工程手段，體外表達或人工合成病原微生物的抗原表位，將其作為一種疫苗使用［1］。表位又稱抗原決定簇，是抗原分子中決定抗原特異性的化學基團，它是能夠與T細胞抗原受體TCR或B細胞抗原受體BCR特異性結(jié)合的基本單位，最終激起機體的免疫反應，形成對病原微生物的免疫能力。因此，表位疫苗符合未來疫苗發(fā)展的方向。

1 表位篩選

要研制表位疫苗，首先要篩選出需要的表位。表位是一個免疫學概念，因此表位的鑒定可以利用與其相關的免疫反應來實現(xiàn)，T細胞表位利用細胞免疫應答鑒定，B細胞表位利用表位與抗體的特異反應鑒定［2］。

1.1 蛋白質(zhì)降解法

蛋白質(zhì)降解法是用一些化學物質(zhì)或者酶將蛋白質(zhì)降解成多個多肽片段，然后從降解得到的肽混合物中分離得到目的肽。利用化學降解法已成功從多種蛋白，例如谷蛋白、細胞色素b、珠蛋白、血清蛋白中分離得到抗原表位多肽。酶法主要是用酶水解抗原抗體復合物，其原理是抗原抗體復合物的結(jié)合部位能抵抗蛋白酶的水解作用［3］?；瘜W法與水解法確定抗原表位的特異性高，但操作復雜繁瑣，只能獲得線性表位。

1.2 肽探針掃描技術

根據(jù)已知病毒的蛋白基因序列，合成連續(xù)重復的重疊多肽，通過與抗體的結(jié)合，篩選出陽性片段。這一技術要求明確抗原分子的一級結(jié)構，只能檢測抗原線性表位?？谔阋卟《荆‵oot－and－mouth disease virus，F(xiàn)MDV）細胞表位的確定大多使用此法 。Jerner W等［4］對覆蓋FMDV蛋白全長的442段十五肽進行了淋巴細胞功能檢測，最終確定了位于VP1上第66～80位氨基酸的一個牛主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）特異的T細胞表位。這種方法的優(yōu)點是鑒定的T細胞表位較可靠，且能發(fā)現(xiàn)一些不符合肽結(jié)合基序（motif）的MHC分子結(jié)合抗原肽。但這種方法也有其局限性，不但工作量大、費用高，而且重疊之間的表位有可能被忽略，所以不能夠鑒定出目的蛋白上所有T細胞表位。

1.3 隨機肽庫技術

將編碼表位多肽的寡聚核苷酸整合到編碼噬菌體表面蛋白的基因上，該基因表達后的蛋白中含有目的多肽，展示在噬菌體表面。通過設計出編碼不同多肽的寡聚核苷酸可以在噬菌體表面展示多達109以上不同的多肽序列，幾乎可以涵蓋所有的抗原表位。利用抗原表位可以與抗體進行特異性結(jié)合的特性，篩選出目的抗原表位，然后將抗體固定在酶標板上，與肽庫噬菌體結(jié)合，洗去未結(jié)合的噬菌體，經(jīng)過幾輪篩選，就可以得到能夠與抗體特異性結(jié)合的噬菌體。通過DNA序列分析，得出該噬菌體攜帶的外源序列，進而得出目的表位的氨基酸序列。

Gazarian K等［5］最近利用噬菌體展示技術，構建了展示7肽至12肽的豬偽狂犬病病毒的噬菌體展示庫，最后篩選出一個由10個氨基酸組成的共有基序，免疫C57BL／6小鼠后發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了偽狂犬病病毒的血清中和抗體，攻毒試驗表明除了2只小鼠外，其余小鼠都能夠存活。

1.4 計算機表位預測

計算機表位預測是指通過計算機軟件預測B細胞表位或者T細胞表位。在已知抗體蛋白結(jié)構的基礎上，可以做到既能預測構象表位，又能預測線性表位，并能夠用圖直觀的表示出來。在已知氨基酸序列的基礎上，可以利用氨基酸的理化數(shù)據(jù)特征，預測可能含有表位的區(qū)域。此外，也可以在噬菌體展示技術的基礎上預測表位。Saha S等［6］采用了一種分類算法，該系統(tǒng)檢驗了源于Bcipep數(shù)據(jù)庫的700個非冗余B細胞表位和源于Swiss－Prot數(shù)據(jù)庫的700個長度為10個～20個氨基酸的隨機選擇多肽，準確率接近66%。另外，由于T細胞免疫的過程首先需要MHC分子與抗原表位緊密結(jié)合，形成復合體。目前已有多種軟件可以根據(jù)復合物的三維構象、結(jié)合多肽的氨基酸序列等信息預測表位［7］。

2 表位疫苗的載體

由于表位多肽只是一段氨基酸殘基，免疫原性較差，且容易被降解，因此在實際使用過程中需要借助一定的載體才能發(fā)揮免疫作用。

2.1 脂質(zhì)載體

脂質(zhì)分子本身不具備免疫原性，但可以作為載體連接在抗原肽的末端，幫助肽分子被抗原呈遞細胞識別，不僅使表位多肽在機體內(nèi)能夠穩(wěn)定存在而不被降解，而且可以增強免疫應答反應。因此，脂質(zhì)分子是一種較為理想的表位疫苗載體。

Theradigm－HBV制劑是一種治療乙肝的表位疫苗，該表位疫苗含有乙肝病毒18～27肽段的CTL（cytotoxic T leukocyte）表位，該表位肽段與脂質(zhì)分子棕櫚酸連接從而組成一種脂質(zhì)表位疫苗，該疫苗已經(jīng)在小鼠和人體內(nèi)試驗成功［8］。另外，抗流感病毒和抗艾滋病病毒的脂肽疫苗的研究也取得了一定的成果。

免疫刺激復合物（immunostimulating complex，ISCOM）是20世紀80年代發(fā)明的一種脂質(zhì)體，其主要成分為一種皂角素（Quil A），它可以包裹病原微生物的抗原蛋白或者多肽，在體內(nèi)緩慢釋放并誘導機體產(chǎn)生免疫反應。目前ISCOMs應用較為廣泛，吳隼等［9］利用中國倉鼠卵巢細胞表達的重組型乙肝病毒表面抗原制備成免疫刺激復合物型疫苗，為ISCOMs型乙肝疫苗的研制奠定了基礎［9］。Pahar B等［10］最近將猿猴感染的HIV的輔助性T細胞表位和CTL表位與ISCOM相連形成免疫原，接種恒河猴后能夠誘導機體產(chǎn)生一定水平的抗HIV免疫保護性反應。

2.2 蛋白載體

乙型肝炎病毒（乙肝病毒）的核心蛋白能夠允許一定程度的缺失和插入，并且能夠?qū)⑼庠葱蛄懈呙芏鹊乇┞对诘鞍最w粒表面。2008年，Gregson等報道了將乙肝病毒核心蛋白的78位和79位氨基酸之間插入惡性瘧原蟲免疫顯性B細胞表位［（NANP）3］和一個 HLA（human leukocyte antigen）限制性CD4表位 （NANPNVDPNANP），并在 HBc的149位氨基酸后融合一個通用的T細胞表位（326aa～345aa），制成重組的表位疫苗，在歐洲一些國家臨床試驗證明該疫苗在所有劑量水平上都是安全的，而且有很好的耐受性。英國Acambis公司研制的針對流感病毒所有A型株的表位疫苗ACAM－FLU－A（TM），以乙肝病毒的核心蛋白氨基端163個氨基酸作為載體來遞送流感病毒離子通道蛋白M2的胞外結(jié)構域M2e，臨床試驗證明該疫苗具有很好的耐受性和免疫原性［11］。

熱休克蛋白（HSP）也可作為表位疫苗的蛋白載體，在腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用，通過分子載體的作用將抗原肽呈遞APC表面，激活CD8＋T細胞，達到殺傷腫瘤細胞的目的。HSP根據(jù)分子量的不同分為4類，即HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族和最小的HSP家族?，F(xiàn)在認為，HSP90家族和HSP70家族與外來抗原的攝入及參與MHC－Ⅰ類分子的結(jié)合有關。HSP70家族的成員還參與新生肽的折疊，并協(xié)助表位肽與TAP（transporter associated with antigen processing）的結(jié)合。Ren F等［12］將 HSP與人乳頭瘤病毒 HPB－16E7的CTL表位多肽偶聯(lián)，并以腺病毒作為多肽DNA的載體，形成的DNA疫苗能夠很好地清除動物模型中的腫瘤細胞，并可誘導CTL細胞的活化。另外，卵清蛋白（OVA）、牛血清蛋白 （BSA）、鑰孔血藍蛋白（KLH）等也可作為表位疫苗的蛋白載體。肖志軍等［13］將傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白線性B細胞抗原表位肽PJ14和PJ15與OVA偶聯(lián)免疫小鼠，結(jié)果顯示，免疫小鼠產(chǎn)生了PJ14和PJ15抗體，持續(xù)期達21周。宋幸輝等［14］將傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白線性B細胞抗原表位肽P22與牛血清蛋白（BSA）偶聯(lián)，并得到了相應的抗原，臨床試驗證明具有一定的免疫保護作用。朱彥彩等［15］采用DEC一步法將His6多肽與KLH偶聯(lián)，制備人工結(jié)合抗原免疫小鼠，成功制備了His6免疫原。

2.3 佐劑

為了加強多肽疫苗的免疫效果，有時候使用佐劑作為一種載體與多肽疫苗一起進行免疫。目前最常用的是弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。弗氏佐劑是一種經(jīng)典的免疫佐劑，分為完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑。Siegel C T等［15］將ras突變體多肽加完全弗氏佐劑免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)10d內(nèi)小鼠T細胞活化，14d內(nèi)出現(xiàn)針對該多肽的遲發(fā)型超敏反應。石統(tǒng)東等［16］合成了基于免疫優(yōu)勢性 HbcAg CTL表位、PreS2B細胞表位和破傷風類毒素通用Th表位的多肽，經(jīng)弗氏佐劑乳化后免疫小鼠，經(jīng)檢測小鼠產(chǎn)生了特異性抗體。

氫氧化鋁可以吸附表位多肽，也可作為一種載體用在表位疫苗的研制上。Hariharan K等［17］用氫氧化鋁或鋁鹽作為HPV－16E7多肽疫苗的佐劑免疫C3H小鼠，用HOPE2腫瘤細胞攻擊小鼠，發(fā)現(xiàn)用氫氧化鋁化鋁鹽佐劑較PROVAXTM佐劑更能明顯抑制腫瘤細胞的生長。而Ghochikyan等的研究發(fā)現(xiàn)，將老年癡呆癥病毒的輔助性T細胞表位2（Th2）的佐劑由氫氧化鋁換為Quil A后，免疫后產(chǎn)生的抗體要高于只使用氫氧化鋁佐劑乳化表位疫苗。可見，目前對于氫氧化鋁佐劑在表位疫苗方面的的應用效果還不是十分明了。

3 表位疫苗的優(yōu)化

在實際的應用中，為增強表位疫苗的免疫活性，還需要采用各種方式對表位疫苗進行優(yōu)化。

3.1 抗原表位線性串聯(lián)

抗原表位線性串聯(lián)是指采用人工合成的方法將多個不同的抗原表位串聯(lián)起來，構建具有多種表位肽的復合多價表位疫苗，該方法可以有效增強抗原表位多肽的免疫原性，同時也能夠避免載體的引入可能造成的不確定影響。吳紹強等［18］利用分子生物學軟件分析了FMDV結(jié)構蛋白VP1～VP3上可能的抗原表位，并人工合成了8條表位多肽。通過采用SATⅡ型FMDV陽性血清進行ELISA反應，檢測其反應原性，然后通過采用與載體蛋白偶聯(lián)的合成肽免疫接種小鼠，測定小鼠血清中抗體效價，檢測合成肽的免疫原性。結(jié)果表明，合成的8條多肽均能與SATⅡ型FMDV陽性血清結(jié)合，其中的6條多肽免疫小鼠后能產(chǎn)生針對多肽的抗體。研究發(fā)現(xiàn)，當表位串聯(lián)時一般要串聯(lián)30個以上的氨基酸才具有較好的免疫原性［19］。

3.2 MAP空間模式

多價抗原肽（multiple antigen peptide，MAP）是將病原微生物蛋白表面的多種B細胞或T細胞表位的氨基酸連接于樹枝狀的多聚賴氨酸結(jié)構上，構建一種立體結(jié)構的多價表位疫苗，這種方式鏈接的表位多肽可以具有較好的方向性，但是賴氨酸骨架的化學合成成本較高。Joshi M B等［20］將瘧疾的多個T細胞以及B表位多肽連接到寡聚氨基酸叢狀結(jié)構上，構建MAP抗原，免疫小鼠，結(jié)果顯示其具有一定的免疫活性。

3.3 表位修飾

在表位串聯(lián)時可能會在連接處產(chǎn)生新的表位，從而影響原表位的免疫活性。婁加陶把結(jié)核桿菌抗原 Rv0309、Rv0173的 HLA－A－＊0201限制性CD8＋CTL表位與其他已知抗原表位優(yōu)化組合，并引入PADRE及“木馬肽”序列，采用furin肽酶識別基序RVKR作為接頭，構建并重組表達、純化“串珠式”表位肽疫苗，并在細胞水平上對其免疫原性進行分析。結(jié)果表明，重組表達的“串珠式”表位肽在細胞水平上能誘導出更強的CTL保護性應答反應［21］。石統(tǒng)東等研究發(fā)現(xiàn)，設計HBV治療性表位多肽疫苗時，在CTL表位的基礎上引入“Th＋B”細胞表位以及3個丙氨酸的間隔序列，可以爭強CTL表位肽的免疫原性［22］。雖然MHC分子與表位的結(jié)合是特異性的，但這種特異性不是指只能與單一的肽段結(jié)合，而是指可以識別一系列具有某些共同特性的肽段，其中包括一些經(jīng)過修飾的非天然肽段，即修飾的肽配體（altered peptide ligand，APL）。通過對肽分子進行修飾，在特定的位置替換成與 MHC有較高親和力的氨基酸，有利于表位肽與MHC分子的結(jié)合。唐艷將黑色素瘤相關抗原 MART1／MelanA（27～35）（AAGIGILTV）表位的P1位由L替換為A，提高了表位的免疫原性［23］。

4 表位疫苗的使用現(xiàn)狀

與傳統(tǒng)疫苗相比，表位疫苗有著明顯的優(yōu)勢，目前，表位疫苗在腫瘤以及病毒性疾病的預防方面已經(jīng)有了較廣泛的應用，同時在細菌、寄生蟲等引起的疾病的防治中也取得了一定的進展。

4.1 腫瘤多肽疫苗

腫瘤多肽表位疫苗是來自腫瘤特異性抗原、病毒相關抗原、癌基因或癌基因突變蛋白的多肽組成的疫苗。Powell D J等［24］用相關多肽皮下注射5位黑色素瘤患者，經(jīng)過1年的治療，患者循環(huán)系統(tǒng)中相應的細胞毒性T細胞從4.8%上升至35.1%，并出現(xiàn)了記憶T細胞。Letsch A等［25］運用表位疫苗治療9名至少經(jīng)過3次黑色素瘤切除后又復發(fā)的患者，并進行長期隨訪，觀察發(fā)現(xiàn)治療效果明顯，該研究小組因此認為應用多肽疫苗可延長惡性黑色素瘤復發(fā)時間間隔。

4.2 病毒表位疫苗

20世紀80年代，Strohmaier K等［26］發(fā)現(xiàn)FMDV含有能引起細胞免疫應答的特殊氨基酸位點，即病毒表位，從而開始了病毒表位疫苗的研究。目前，HIV以及丙型肝炎病毒等相關的表位疫苗也進入臨床試驗。Kran A M 等［27］使用 Vacc－4x肽疫苗，免疫40位HIV陽性患者，無任何不良反應。同時，體外誘導T細胞增殖試驗，結(jié)果產(chǎn)生明顯的免疫應答反應。Chua B Y等［28］通過CD4＋T細胞輔助表位合成一種脂肽，能誘導產(chǎn)生有效的CD8＋T細胞應答，清除患者體內(nèi)的HCV病毒。

4.3 細菌表位疫苗

表位疫苗在抗菌方面的應用也較為廣泛。Chen J G等［29］構建了銅綠假單胞菌多表位MyD88基因疫苗，成功地刺激小鼠產(chǎn)生高度特異性的抗體，氣管接種該疫苗的小鼠肺勻漿細菌計數(shù)明顯低于對照組。另外，周維英等［30］構建了幽門螺旋桿菌黏附素和尿素酶B亞單位雙亞基多表位疫苗，免疫檢測有較好的免疫原性。

4.4 寄生蟲表位疫苗

抗寄生蟲的表位疫苗相對較少，目前僅有少數(shù)寄生蟲表位疫苗的使用。賈逵等將弓形蟲新基因wx2中的2個編碼表位的片段w2a和w2b構建到重組質(zhì)粒中，制成表位基因疫苗免疫小鼠，獲得了較好的效果［31］。另外，對抗日本血吸蟲病表位疫苗的研究也取得了一定進展。

5 問題和展望

目前，表位疫苗的應用仍面臨許多亟待解決的問題。例如，表位的作用機制尚不完全清楚；表位多肽分子較小，免疫原性較弱，而佐劑的使用一定程度上會增加表位疫苗的副作用；多肽合成以及純化技術的局限性也增加了表位疫苗的使用風險。另外，筆者認為表位研究的不均衡也是目前表位疫苗研究中存在的一個主要問題，尤其對于動物病毒。譬如，對于FMDV，此前的表位研究主要集中于B細胞表位和Th細胞表位，而缺乏對CTL細胞表位的研究，導致表位疫苗中表位的組成缺乏必要的CTL表位。目前，筆者所在課題組正在篩選FMDV的CTL表位，為今后開發(fā)和研制FMDV的CTL表位奠定基礎。

總之，在今后的表位疫苗研制過程中，還有許多方面亟待完善，因此需要從事表位研究的科研工作者堅持不懈的努力。

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