李平 綜述 汪茂榮 審校

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染呈世界流行，每年約有100萬(wàn)人死于HBV相關(guān)的肝衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌，已成為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1，2]。核苷（酸）類藥物（Nucleos/tide analogues）是目前治療慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的重要藥物，具有抑制病毒迅速、作用效果明顯、使用方便和不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，但是大多接受核苷（酸）類藥物治療的患者難以在短期內(nèi)達(dá)到持久應(yīng)答，而且隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，HBV易產(chǎn)生變異耐藥，造成抗病毒治療的失敗。隨著核苷（酸）類藥物種類的增加，可通過(guò)聯(lián)合或替代的方法挽救變異耐藥，但是位于逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，RT）區(qū)B亞區(qū)第181位氨基酸的變異給抗病毒治療提出了一個(gè)新的“挑戰(zhàn)”，因?yàn)槠渥儺惡蟛粌H僅對(duì)阿德福韋產(chǎn)生耐藥，而且對(duì)拉米夫定、恩替卡韋、替比夫定、替諾福韋的藥物敏感性均呈現(xiàn)下降，是一個(gè)交叉核苷和核苷酸兩類藥物的耐藥位點(diǎn)[3]。

一、rt181變異的概念

野生型HBV rt181位氨基酸是丙氨酸（Ala，A），編碼的堿基為GCT。rt181變異主要有兩種模式：當(dāng)編碼密碼子第一位堿基的G突變?yōu)锳后，氨基酸變異為蘇氨酸（Thr，T），可寫作rtA181T；而當(dāng)編碼第二位堿基的C突變?yōu)門后，丙氨酸則變異為纈氨酸（Val，V），可寫作rtA181V。由于HBV聚合酶基因和表面抗原基因存在部分重疊區(qū)域，RT區(qū)的變異也引起S區(qū)的改變，rtA181T變異可導(dǎo)致S蛋白第172位色氨酸（Trp，W）變異為終止密碼子，寫作sW172*；或者置換變異為亮氨酸（Leu，L），寫作sW172L。而rtA181V變異則導(dǎo)致S蛋白第173位氨基酸由亮氨酸（Leu，L）變異為苯丙氨酸（Phe，F(xiàn)），寫作 sL173F。

二、rt181變異的產(chǎn)生

臺(tái)灣學(xué)者Yeh等[4]最早報(bào)道了rt181變異，其對(duì)23例拉米夫定治療耐藥的患者進(jìn)行分析，其中有3位患者體內(nèi)HBV沒有出現(xiàn)常見的YMDD（M552I/V）變異，而是出現(xiàn)了A529T（rtA181T）變異，他們進(jìn)一步用定點(diǎn)突變的方法在體外證明了rtA181T變異株對(duì)拉米夫定耐藥。2004年Chien[5]等也報(bào)道在接受拉米夫治療的CHB患者中，有1例患者出現(xiàn)了A529T（rtA181T）變異，并且在停藥1年后還能檢測(cè)到該變異的存在。2006年，法國(guó)學(xué)者Gerolami等[6]報(bào)道在2例接受拉米夫定治療的患者中，出現(xiàn)rt181的另一種變異模式，即rtA181V變異。

一項(xiàng)關(guān)于阿德福韋的多中心隨機(jī)雙盲對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)[7]，185例患者經(jīng)過(guò)144周的治療后，除了3例出現(xiàn)rtN236T變異外，另有3例患者出現(xiàn)rtA181V耐藥變異。Yeon等[8]給67例拉米夫定耐藥的患者換用阿德福韋治療，治療7周后，有2例患者在出現(xiàn)rtA181T變異；治療12周后，有5例患者出現(xiàn)rtA181V變異。在替比夫定治療的患者中，也同樣發(fā)現(xiàn)rt181位點(diǎn)的變異的存在。替比夫定Ⅲ期全球注冊(cè)的臨床研究結(jié)果提示[9]，在治療52周HBV DNA陽(yáng)性的115名患者中，有16人出現(xiàn)rt181位點(diǎn)的變異。而在恩替卡韋初始治療的患者中，國(guó)內(nèi)302醫(yī)院趙攀等[10]對(duì)5例HBV rtA181T/V變異患者的臨床資料進(jìn)行回顧性調(diào)查和隨訪后認(rèn)為：rtA181T/V變異的產(chǎn)生與恩替卡韋治療無(wú)關(guān)，其變異為自然產(chǎn)生。Warner等[11]對(duì)SeqHepB數(shù)據(jù)庫(kù)中患者資料進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，在未接受任何抗病毒治療的患者中可檢測(cè)到rtA181T變異的存在。

三、變異的臨床特點(diǎn)

（一）變異發(fā)生率 rt181變異的發(fā)生率在不同研究中的比例略有區(qū)別。澳大利亞的SeqHepB數(shù)據(jù)庫(kù)中統(tǒng)計(jì)資料顯示[11]：在拉米夫定治療變異的患者中，rtA181T比例為2%；在阿德福韋治療變異的患者中，rtA181T比例為18%，rtA181V的比例達(dá)到50%。而在未接受抗病毒治療的患者中，rtA181T出現(xiàn)的概率為0.2%。國(guó)內(nèi)徐東平等[12]對(duì)340例CHB患者體內(nèi)HBV進(jìn)行耐藥分析，其中rtA181T變異檢出率3.2%，rtA181V檢出率0.3%，rtA181T/V/I檢出率0.6%。國(guó)內(nèi)另一篇文獻(xiàn)[13]對(duì)85例CHB患者的HBV測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，有2例患者發(fā)生rtA181T變異，2例rtA181V變異，1例rtA181S變異。

（二）變異的組合 和rt204變異一樣，rt181變異既可單獨(dú)存在，又可與其他變異同時(shí)存在，不同變異可存在于同一株病毒株上，也可分別存在于不同的病毒株。對(duì)rt181變異患者的HBV的RT區(qū)序列進(jìn)行克隆分析，發(fā)現(xiàn)rtA181T/V變異可單獨(dú)存在，也可與 N236T、M204V/I、N236+N238T、L80V、L80V+M204I等變異同時(shí)存在[14，15]。

四、變異的生物學(xué)特點(diǎn)

（一）復(fù)制特性 HBV DNA變異后對(duì)于病毒復(fù)制能力的影響是多種多樣的，可降低其復(fù)制能力，可提高其復(fù)制能力，或沒有影響。在rt181變異的研究中，大部分學(xué)者認(rèn)為rtA181T變異后，HBV復(fù)制能力下降。Yeh等[4]最早發(fā)現(xiàn)rtA181T變異的同時(shí)，在體外構(gòu)建突變株，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測(cè)復(fù)制產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，rtA181T變異病毒的復(fù)制活性比野生型下降了約88%。Warner等[11]構(gòu)建rtA181T突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Huh 7細(xì)胞后，他們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制中間體明顯減少，而在細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測(cè)不到HBV DNA。Yatsuji等[16]通過(guò)構(gòu)建1.4拷貝的HBV rtA181T突變株轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，他們發(fā)現(xiàn)HBV DNA水平下降了約20%。關(guān)于rtA181V變異對(duì)復(fù)制的影響，只有李新艷等[17]學(xué)者將臨床分離的rtA181V變異株轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)HBV DNA水平與野生型相比并未見明顯差異。而韓國(guó)學(xué)者[18]將rtA181T/V變異患者的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，他們將13例rtA181T/V變異患者與9例rt181未變異者配對(duì)后認(rèn)為，兩組患者在HBV DNA水平并沒有表現(xiàn)出差異。國(guó)內(nèi)有學(xué)者將rtM204位點(diǎn)單獨(dú)突變與rtM204+rtA181T突變患者兩者進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)引起他們變異所用的核苷酸藥物不同，但兩者病毒學(xué)水平無(wú)明顯差異[19]，而對(duì)rtN236T變異患者與rtA181T變異患者進(jìn)行比較后，發(fā)現(xiàn)兩組患者的HBV DNA水平也沒有顯著差異[20]。

（二）表面抗原（HBsAg）表達(dá) rtA181T/sW172*變異后，會(huì)導(dǎo)致HbsAg合成出現(xiàn)缺陷且引起分泌障礙。Warner等[11]研究發(fā)現(xiàn)，由于該變異提前出現(xiàn)終止密碼子，可使HBsAg截短約55個(gè)氨基酸，隨后他們利用Western證實(shí)了HBV變異株的表面蛋白減小了6kD；而Western檢測(cè)同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染變異病毒的Huh7細(xì)胞內(nèi)HBsAg含量明顯下降，細(xì)胞外HBsAg檢測(cè)不到。他們進(jìn)一步通過(guò)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，rtA181T/sW172*變異后的HBsAg在細(xì)胞漿內(nèi)大量聚集，不能正常分泌到細(xì)胞外。盡管在體外研究中證實(shí)HBsAg分泌缺陷，但在臨床上，發(fā)生rtAl81T變異患者的血清HBsAg滴度與未變異者并無(wú)明顯差異[18]。其可能的原因是：患者體內(nèi)的病毒群是混合的，即同時(shí)存在非變異毒株，這些毒株所產(chǎn)生的非變異型HBsAg可以裝配變異的HBV，并糾正分泌缺陷。Warner等[11]按不同比例轉(zhuǎn)染變異株和未變異株質(zhì)粒，隨著未變異株質(zhì)粒所占比例的增加，HBV分泌缺陷能夠被逐漸挽救。國(guó)內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)rtAl81非變異株占10%時(shí)，即可在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到HBsAg表達(dá)，且隨著非變異株所占比例增加，HBsAg表達(dá)也逐步增加，表明rtAl81T/sWl72＊變異株導(dǎo)致的HBsAg分泌缺陷已被rtl81非變異株糾正[17]。

（三）藥物敏感性 藥物敏感性通常用半數(shù)有效濃度（EC50）或半數(shù)抑制濃度（IC50）來(lái)評(píng)價(jià)，其原理是定點(diǎn)突變或從體內(nèi)分離出變異的病毒株，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，再加入不同濃度的核苷（酸）類似物，培養(yǎng)一段時(shí)間后檢測(cè)HBV復(fù)制情況，并與野生株病毒的EC50/IC50比較，判斷耐藥性。目前體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，rtA181T/V變異病毒對(duì)大部分核苷（酸）類藥物均呈現(xiàn)一定程度的耐藥性。Villet等[14]實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，rtA181T變異病毒對(duì)拉米夫定、阿德福韋、替諾福韋的藥物敏感性分別下降了5.7～10.8倍，2.1～4.5倍，2～2.9倍；rtA181V變異病毒則分別下降了 1.5～7.7倍，2.4～7.8倍，1.2～3.2倍；而 rtA181T或 rtA181V變異病毒對(duì)恩替卡韋的敏感性改變尚不明顯。他們研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)出現(xiàn)rtA181T/V聯(lián)合rtN236T變異后，耐藥性較rtA181T/V單點(diǎn)變異明顯上升。而有學(xué)者等[21]研究發(fā)現(xiàn)，rtA181V變異病毒株對(duì)阿德福韋、替諾福韋的敏感性分別降低了4.2倍和3倍；但對(duì)拉米夫定、恩替卡韋和恩曲他濱的敏感性降低12～15倍，對(duì)其他核苷類似物，包括克來(lái)夫定、替比夫定、L-dC、L-dA則呈現(xiàn)完全交叉耐藥（敏感性下降＞80倍）。

（四）與腫瘤關(guān)系 臺(tái)灣學(xué)者Lai等[22]對(duì)一位39歲的血清HBeAg陽(yáng)性，而HBsAg陰性的肝癌患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其HBsAg陰轉(zhuǎn)是由于體內(nèi)HBV出現(xiàn)了rtA181T/sW172*變異。他們進(jìn)行體外研究發(fā)現(xiàn)rtA181T/sW172*變異能夠轉(zhuǎn)錄激活猿猴空泡病毒40（SV 40）和癌基因c-Myc，從而促使腫瘤的發(fā)生。而他們利用裸鼠進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，rtA181T/sW172*變異的細(xì)胞可在裸鼠體內(nèi)促使腫瘤的形成。國(guó)內(nèi)[23]也報(bào)道：rtA181T/sW172*變異后，HBsAg的分泌缺陷導(dǎo)致蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積，可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)通路grp78基因，從而誘使肝癌的發(fā)生。

五、rt181變異的對(duì)策

目前尚無(wú)臨床試驗(yàn)對(duì)HBV rt181耐藥患者的治療方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，僅有一些臨床治療的經(jīng)驗(yàn)報(bào)道。有研究[21]報(bào)道，接受阿德福韋治療產(chǎn)生rtAl81V變異的患者，改用或加用拉米夫定能使HBV DNA降低2-3個(gè)logl0 copies/ml，但并不能完全抑制HBV復(fù)制。他們認(rèn)為rtAl81V變異病毒對(duì)替諾福韋敏感性改變最少。但是Patterson等[24]通過(guò)96周的隨訪發(fā)現(xiàn)，TDF治療rtA181T/V變異患者的抑制病毒能力明顯下降，尤其是rtA181V合并rtN236T同時(shí)變異時(shí)，突變株能使TDF抗病毒活性下降10倍以上。Kurashige等[25]報(bào)道1位e抗原陽(yáng)性，HBV DNA大于7.6 log10copies/ml的患者，在接受拉米夫定治療后，出現(xiàn)rtA181T變異，當(dāng)換用恩替卡韋后，病毒量起初略有下降，隨后即出現(xiàn)反彈，而此時(shí)耐藥轉(zhuǎn)為rtM204V+L180M+S202G變異，當(dāng)聯(lián)用拉米夫定和阿德福韋后，rtA181T變異再次成為主要變異；最后聯(lián)用恩替卡韋和阿德福韋后，病毒降到了3.7 log10 copies/ml。他們認(rèn)為恩替卡韋和阿德福韋聯(lián)用，能最大程度控制rtA181T和rtM204V的相關(guān)耐藥。而一些個(gè)案報(bào)道[26]認(rèn)為，rtA181T/V變異的患者，換用恩替卡韋治療后，能夠有效抑制病毒復(fù)制。目前EASL建議[27]這些發(fā)生rtA181T/V變異的患者，給予其加用恩替卡韋，或者使用替諾福韋聯(lián)合恩曲他濱，但是在臨床上能否有效抑制反彈的變異病毒，目前還有待進(jìn)一步的觀察和隨訪。

六、結(jié)語(yǔ)

核苷（酸）類藥物通過(guò)與HBV DNA聚合酶的自然底物dNTP競(jìng)爭(zhēng)，而抑制HBV復(fù)制。在藥物或免疫的長(zhǎng)期壓力下，在HBV復(fù)制過(guò)程中（尤其在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中），由于聚合酶缺乏嚴(yán)格校正機(jī)制，HBV聚合酶區(qū)會(huì)出現(xiàn)較高頻率的變異，相應(yīng)氨基酸序列改變后影響到空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致核苷（酸）類藥物與聚合酶結(jié)合能力明顯降低，便發(fā)生了耐藥現(xiàn)象。當(dāng)前除恩替卡韋以外的核苷（酸）藥物幾乎均可導(dǎo)致rt181變異的產(chǎn)生。雖然其變異后病毒缺陷，病毒量不會(huì)大幅度的反彈，HBsAg、ALT的水平也沒有明顯改變[28]。但由于其交叉核苷和核苷酸耐藥，對(duì)即將在國(guó)內(nèi)上市的替諾福韋亦不敏感，因此給臨床長(zhǎng)遠(yuǎn)的治療用藥帶來(lái)困難。

在臨床工作中，我們?cè)谂ふ夷退幾儺悓?duì)策的同時(shí)，更應(yīng)做好耐藥的預(yù)防工作。對(duì)于需要長(zhǎng)期抗病毒治療的患者來(lái)說(shuō)，可選用抑制HBV能力強(qiáng)、耐藥發(fā)生率低的藥物；或選擇核苷與核苷酸類藥物聯(lián)合用藥，以減少或延緩耐藥性的發(fā)生。

[1]Ganem D，PrinceAM.HepatitisB virusinfection-natural history and clinical consequences.N Engl J Med，2004，350（11）:1118-1129.

[2]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.實(shí)用肝臟病雜志，2011，14（2）:81-89.

[3]Zoulin F，Locarnini S.Hepatitis B virus resistance to nucleos（t）ide analogues.Gastroenterology，2009，137（5）:1593-608.

[4]Yeh CT，Chien RN，Chu CM，et al.Clearance of the original hepatitis B virus YMDD-motif mutants with emergenceof distinct lamivudine-resistant mutants during prolonged lamivudine therapy.Hepatology，2000，31（6）:1318-1326.

[5]ChienRN.YehCT，WangPN，etal.Acuteleukaemiain chronic hepatitis B patients with lamivudine therapy.Int J Clin Pract，2004，58（11）:1088-1091.

[6]Gerolami R，Bourliere M，Colson P，et al.Unusual selection of rtA181V HBV mutants crossresistantto adefovir following prolonged lamivudine monotherapy:report of two cases.Antivir Ther，2006，11（8）:1103-1106.

[7]Hadziyannis SJ，Tassopoulos NC，Heathcote EJ，et al.Long-term therapy with adefovir dipivoxil for HBeAg-negative chronic hepatitis B.N Engl J Med，2005，352（26）:2673-2681.

[8]Yeon JE，Yoo W，Hong SP，etal.Resistance to adefovir dipivoxil in lamivudine resistant chronic hepatitis B patients treated with adefovir dipivoxil.Gut，2006，55（10）:1488-1495.

[9]Lai CL，Gane E，Liaw YF，et al.Telbivudine versus lamivudine in patients with chronic hepatitis B.N Engl J Med，2007，357（25）:2576-2588.

[10]趙攀，鐘彥偉，徐東平.5例應(yīng)用恩替卡韋治療的慢性HBV感染者發(fā)生HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)單獨(dú)A181位點(diǎn)突變的分析.臨床肝膽病雜志，2011，27（3）:289-291.

[11]Warner N，Locarnini S.The Antiviraldrug selected hepatitis B virus rtA181T/sW172* mutant has a dominant negative secretion defect and alters the typical profile of viral rebound.Hepatology，2008，48（1）:88-98.

[12]徐東平，劉妍，成軍，等.340例慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒多位點(diǎn)耐藥相關(guān)突變分析.中華肝臟病雜志，2008，16（10）:735-738.

[13]吳云海，吳云萍，張曉棠，等.HBV反轉(zhuǎn)錄酶A181位點(diǎn)變異與臨床耐藥的關(guān)系. 肝臟，2009，14（2）:105-107.

[14]Villet S，Pichoud C，Billioud G，et al.Impact of hepatitis B virus rtA181V/T mutants on hepatitis B treatment failure.J Hepatol，2008，48（5）:747-755.

[15]吳珍萍，韓濤，高英堂，等.拉米夫定耐藥后阿德福韋酯治療應(yīng)答欠佳患者乙型肝炎病毒耐藥變異模式.中華肝臟病雜志，2010，18（5）:498-501.

[16]Yatsuji H，Noguchi C，Hiraga N，et al.Emergence of a novel lamivudine-resistant hepatitis B virus variant with a substitution outside the YMDD motif.Antimicrob Agents Chemother，2006，50（11）:3867-3874.

[17]李新艷，尹有寬，張繼明，等.阿德福韋耐藥乙型肝炎病毒毒株生物學(xué)特性的研究.中華傳染病雜志，2009，27（8）:478-483.

[18]Kim JH，Jung YK，Joo MK，et al.Hepatitis B viral surface mutations in patients with adefovir resistant chronic hepatitis B with A181T/V polymerase mutations.JKorean Med Sci，2010，25（2）:257-264.

[19]王春亞，鐘彥偉，劉杰，等.HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)M204位點(diǎn)單獨(dú)突變患者與M204+A181T聯(lián)合突變患者臨床特征的比較.實(shí)用肝臟病雜志，2010，13（4）:260-262.

[20]王春亞，鐘彥偉，楊昊臻，等.HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)N236T突變與A181T突變患者的臨床特征的比較.實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2010，7（4）:47-48.

[21]Qi X，Zhu Y，Curtis M，et al.In vitro cross-resistance analysis of the HBV polymerase mutation A181V.J Hepatol，2005，42（Suppl 2）:194-195.

[22]Lai MW，Yeh CT.The oncogenic potential of hepatitis B virus rtA181T/surface truncation mutant.Antivir Ther，2008，13:875-879.

[23]鄭佳佳，蔣素貞，張婷，等.HBV sW172*耐藥突變體引起的截短蛋白胞內(nèi)堆積可能通過(guò)ER stress通路參與致肝癌機(jī)制.南京:第15屆全國(guó)病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會(huì)議，中華醫(yī)學(xué)會(huì)，2011，100-101.

[24]Patterson SJ，George J，Strasser SI，et al.Tenofovir disoproxil fumarate rescue therapy following failure of both lamivudine and adefovir dipivoxil in chronic hepatitis B.Gut，2011，60（2）:247-254.

[25]KurashigeN，OhkawaK，Hiramatsu N，etal.Twotypesof drug-resistant hepatitis B viral strains emerging alternately and their susceptibility to combination therapy with entecavir and adefovir.Antivir Ther，2009，14（6）:873-877.

[26]Choe WH，Hong SP，Kim BK，et al.Evolution of hepatitis B virus mutation during entecavir rescue therapy in patients with antiviral resistance to lamivudine and adefovir.Antivir Ther，2009，14（7）:985-993.

[27]European Association For The Study Of The Liver.EASL clinical practice guidelines:Management of chronic hepatitis B.J Hepatol，2009，50（2）:227-242.

[28]王春亞，鐘彥偉，劉杰，等.HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)A181T突變的臨床意義. 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31（11）:1125-1126.