王艷萍，郗宏波，姚四平，閔軍濤，朱海霞，王金菊

（天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

乳酸菌發(fā)酵蔬菜已經(jīng)有上千年的歷史，并在世界范圍內(nèi)廣泛流傳，是貯存蔬菜的一種傳統(tǒng)方式，并且賦予蔬菜良好的風(fēng)味及功能[1]。芹菜具有“補(bǔ)血、祛風(fēng)、健脾利濕”的作用，能清理胃中濕濁，如《本草綱目-菜部第二十六卷》就有記載，“芹菜主治女子赤沃，之血養(yǎng)精，保血脈，益氣，令人肥健嗜食[2]?！鼻鄄诉€具有多種藥理降壓作用，如對中樞的鎮(zhèn)靜作用，抗菌作用，利尿作用等，對于降血壓膽固醇都有很好的治療效果[3]。我國是蔬菜種植大國，年產(chǎn)在5萬t以上，占到世界蔬菜總產(chǎn)量的60%以上，芹菜是我國非常大眾化的一種蔬菜，可以占到我國蔬菜種植總數(shù)的二十分之一，常常會出現(xiàn)新鮮芹菜供大于求的局面，大量積壓，最終變質(zhì)，不僅給農(nóng)民造成了極大的損失，而且還造成大量的浪費(fèi)，發(fā)酵芹菜不但可以解決芹菜閑置問題，還可以大大的改善芹菜的風(fēng)味。與新鮮的芹菜相比，發(fā)酵后的芹菜風(fēng)味更佳獨(dú)特，口感、營養(yǎng)、質(zhì)地及其保藏性更佳優(yōu)越，不僅是佐餐佳品，而且還具有刺激食欲、健胃消食、改善腸道環(huán)境促進(jìn)腸胃健康、通便緩瀉等功能。

現(xiàn)在的發(fā)酵蔬菜還是以人工家庭式的自然發(fā)酵為主，會有產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、亞硝酸鹽含

量超過、發(fā)酵時間過長等問題[4]，以乳酸菌接種發(fā)酵不僅可以縮短發(fā)酵周期更加可以提高產(chǎn)品質(zhì)量，使之符合生產(chǎn)化標(biāo)準(zhǔn)。本文用乳酸菌接種發(fā)酵芹菜，通過比較不同菌種的配比，通過考察酸度、pH值、感官等變化，優(yōu)化發(fā)酵芹菜的工藝，為芹菜泡菜的大規(guī)模生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

芹菜、食鹽等均購于當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

1.2 主要儀器與試劑

市售泡菜壇；HFsafe900型超凈工作臺；LRH-250生化培養(yǎng)箱；TA.XT2i質(zhì)構(gòu)分析儀；DELTA-320 pH計；日立高效液相色譜儀。

MRS培養(yǎng)基：牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，NaAC 5.0g，檸檬酸二銨2.0g，K2HPO42.0g，MgSO40.2g，MnSO40.05g，Tween-80 1.0g，蒸餾水定容至1000mL，pH值6.2～6.4，121℃高壓滅菌20min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 泡菜的制作工藝

1.3.2 發(fā)酵芹菜單因素試驗(yàn)

分別選取不同的菌種比例、接種量、鹽濃度，按照上述工藝進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵周期為10d，25℃，其中菌種為實(shí)驗(yàn)室前期篩選出來的優(yōu)良發(fā)酵乳酸菌菌種保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus），因素水平表見表1所示，每組試驗(yàn)3組平行，試驗(yàn)結(jié)果為3組平行的平均值。

表1 發(fā)酵芹菜試驗(yàn)單因素水平因素Table 1 Factors and levels of the celery fermentation experiment

1.3.3 正交試驗(yàn)分析

根據(jù)1.3.2的試驗(yàn)結(jié)果，采用正交試驗(yàn)分析，以感官評分作為評價標(biāo)準(zhǔn)，采用3水平3因素正交試驗(yàn)表，因素水平表見表2所示，感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表3。每組試驗(yàn)3個平行，試驗(yàn)結(jié)果為3組平行的平均值。

表2 發(fā)酵芹菜正交試驗(yàn)水平因素Table 2 Factors and levels of the orthogonal experiment

表3 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation criteria

1.3.4 檢測指標(biāo)

（1）pH檢測

取泡菜汁以pH計測定。

（2）總酸測定

總酸采用滴定法進(jìn)行測定[5]，對泡菜汁的總酸進(jìn)行測定，進(jìn)而間接地了解發(fā)酵效果。

（3）質(zhì)構(gòu)分析

將芹菜切成長度1.0cm～1.2cm相同的小塊，進(jìn)行TPA二次咀嚼試驗(yàn)，試驗(yàn)條件：P-36R探頭預(yù)壓速率2mm/s，下壓速率1mm/s，壓后上行速率1mm/s，2次壓縮中間停頓5s，試樣受壓變形為45%，觸發(fā)力值5g。

（4）有機(jī)酸分析

有機(jī)酸采用HPLC（高效液相色譜）法進(jìn)行分析。

A.樣品的預(yù)處理

5g泡菜汁加入到15mL 0.1（w/v）的磷酸中，4℃條件下7000g離心10min，取上清過0.45μm的濾膜。

B.色譜條件

色譜柱：Apollo C18（5μm，250×4.6mm），柱溫25℃，使用0.1（w/v）的磷酸作為流動相，流速為1.0mL/min，紫外檢測波長210nm，進(jìn)樣量20μL[6]。

C.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品，分別以不同濃度進(jìn)樣檢測，測定不同標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間及其不同濃度對應(yīng)的峰面積，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

D.樣品測定

樣品進(jìn)行預(yù)處理后上機(jī)檢測，記錄數(shù)據(jù)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照定量計算。

（5）亞硝酸鹽檢測

亞硝酸鹽的檢測根據(jù)GB5009.33-2010中的鹽酸萘乙二胺法測定[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵芹菜單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同菌種比例對發(fā)酵芹菜的影響

采用8種不同的菌種比例進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，考察不同發(fā)酵劑對芹菜泡菜的影響，試驗(yàn)條件：接種量5%（v/v），鹽濃度2%（w/v）。

圖1 不同菌種比例對pH值的影響Fig.1 Effects of strains proportion on p H values of pickle

圖2 不同菌種比例對總酸含量的影響Fig.2 Effects of strains proportion on total acids contents

由圖1和2可以看出，混合菌的發(fā)酵都可以達(dá)到一個良好的效果，其中第6組的pH值及酸度都可以達(dá)到一個非常好的程度，而且風(fēng)味口感均很好，所以在正交試驗(yàn)分析時，選取第6組菌種比例作為正交試驗(yàn)中菌種比例的水平。

2.1.2 不同的鹽濃度對發(fā)酵芹菜的影響

試驗(yàn)中固定添加的乳酸菌菌種為第6組菌種比例（Lb:St=2:3），接種量5%，食鹽濃度選取1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%5個水平。結(jié)果見圖3和4。

圖3 不同鹽濃度對pH值的影響Fig.3 Effects of NaCl concentration on pH value

圖4 不同鹽濃度對總酸含量的影響Fig.4 Effects of NaCl concentration on contents on total acids

從pH值和總酸含量可以看出，1%～2%之間的區(qū)別并不是很大，濃度到了2.5后pH值偏高總酸含量偏低，隨著鹽濃度的增加可以看出pH值逐漸升高，總酸含量逐漸降低的趨勢，就是由于鹽會抑制菌的生長，隨著鹽濃度的增加，菌的生長變的緩慢。再通過感官評定認(rèn)為，2%的鹽濃度口味偏重，不太容易被接受，而1%的則口味偏淡，所以在正交試驗(yàn)分析時，選取1.5%水平的加鹽量。

2.1.3 不同接種量對發(fā)酵芹菜的影響

試驗(yàn)中固定添加的乳酸菌菌種為第6組菌種比例（Lb:St=2:3），鹽添加量為1.5%，接種量選取4%、5%、6%、7%4個水平。接種量的大小對于發(fā)酵的主要影響在于菌在發(fā)酵中的生長狀況，接種量大的菌種生長繁殖的快，產(chǎn)酸快，反之接種量小的菌的生長繁殖較慢，產(chǎn)酸緩慢，產(chǎn)酸速度過快時會對發(fā)酵效果產(chǎn)生不好的影響，會使發(fā)酵產(chǎn)品由于短時間內(nèi)酸化，質(zhì)地發(fā)生軟化，但接種量較小時，由于菌種的生長緩慢，會使一些腐敗菌滋生，往往也會對發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)地產(chǎn)生影響。因此通過質(zhì)構(gòu)分析，比較不同接種量發(fā)酵芹菜的硬度、恢復(fù)性、咀嚼性等來考察接種量的影響。結(jié)果見圖5所示。

由圖5可以看出5%的接種量無論是硬度還是彈性、咀嚼度方面都比較好，所以在正交試驗(yàn)分析時，選擇5%水平的接種量。

2.1.4 正交試驗(yàn)分析確定發(fā)酵芹菜的最佳工藝

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，對影響發(fā)酵芹菜質(zhì)量有影響的菌種比例、鹽濃度、接種量3個因素，采用正交試驗(yàn)分析，每個因素3個水平，正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表4。

圖5 不同接種量的質(zhì)構(gòu)分析Fig.5 TPA results of different innoculum

表4 優(yōu)化芹菜泡菜發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Result and analysis of orthogonal tests for fermentation optimization

表5 芹菜泡菜正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of results of orthogonal experiment

由表4可以看出，影響芹菜泡菜的因素順序?yàn)榫N比例＞接種量＞鹽濃度，3個因素中菌種比例對芹菜泡菜的影響較大，這可能是由于乳酸菌作為蔬菜發(fā)酵的啟動者，它的添加量的多少直接影響發(fā)酵效果，嗜熱鏈球菌比保加利亞乳桿菌更容易利用蔬菜汁進(jìn)行生長，且代謝周期短，提高其比例可以加快發(fā)酵速度并產(chǎn)生良好風(fēng)味。芹菜泡菜最佳發(fā)酵條件為菌種及比例為保加利亞乳桿菌:嗜熱鏈球菌（2:3），鹽濃度為1.5%，接種量為6%。

2.1.5 指標(biāo)檢測

用我們所優(yōu)化出來的最佳條件發(fā)酵芹菜，對其進(jìn)行理化指標(biāo)分析。

（1）pH值和總酸的測定

表6 樣品的pH值和總酸測定Table 6 Analysis of p H value and total acids of different samples

有表6可知，樣品的pH值和酸度均可以達(dá)到一個很好的程度，達(dá)到人們可以接受的范圍，相比較傳統(tǒng)自然發(fā)酵，大大縮短了達(dá)到這一程度的發(fā)酵時間。

（2）有機(jī)酸分析

圖6為有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC檢測圖譜，其中峰1為草酸，峰2為甲酸，峰3為蘋果酸，峰4為乳酸，峰5為乙酸，峰6為檸檬酸，峰7為富馬酸，峰8為丙酸。圖7為樣品的有機(jī)酸圖譜。

圖6 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of standard organic acids

圖7 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 The calibration curve of nitrite sodium

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間及含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得樣品的有機(jī)酸含量見表7所示。

有機(jī)酸是構(gòu)成泡菜風(fēng)味的主要物質(zhì)，檸檬酸有爽快的酸味，蘋果酸具有令人愉悅的酸味，而富馬酸具有水果酸味，樣品的有機(jī)酸種類和含量與一般自然發(fā)酵產(chǎn)品無明顯差別，但是樣品中草酸含量較少，草酸會影響人體鈣的吸收。蘋果酸、檸檬酸及乳酸的含量均高于自然發(fā)酵，尤其乳酸。

表7 有機(jī)酸分析結(jié)果Table 7 Organic acids contents of sample

（3）亞硝酸鹽的測定

A.亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

亞硝酸鹽溶液在538nm波長下的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.0165x-0.0067，R2=0.9986。

圖8 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 The calibration curve of nitrite sodium

B.亞硝酸鹽含量

對樣品進(jìn)行亞硝酸鹽的監(jiān)測，亞硝酸鹽的含量為3.14mg/kg，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑委員會建議亞硝酸鹽每日攝食量（ADI）為0～0.07mg/kg體重，那么按照一般常人60kg體重計算，每人每日食用的亞硝酸鹽含量不應(yīng)該超過4.2mg，則每人每日食用芹菜泡菜1kg是毫無安全問題的，可以放心食用。我國的國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，泡菜的亞硝酸鹽含量不應(yīng)該超過20mg/kg，芹菜泡菜遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國標(biāo)，符合國家生產(chǎn)要求。

3 結(jié)論

運(yùn)用優(yōu)化出的最佳發(fā)酵條件，可以快速增加芹菜泡菜體系中的活菌數(shù)量，降低體系中的pH值，提高產(chǎn)酸速率，同時再發(fā)酵后，可以增加芹菜泡菜的風(fēng)味，豐富有機(jī)酸的種類及含量，而且保持了原有芹菜的脆度。這一試驗(yàn)結(jié)果也為我國利用直投式發(fā)酵劑生產(chǎn)安全放心、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一化泡菜發(fā)酵產(chǎn)品做了有益的探索，為未來泡菜的加工市場指明了方向。

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