高衛(wèi)衛(wèi)

(徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院 肛腸科，江蘇 徐州 221000)

生肌玉紅膏具有祛腐生肌之功效，臨床應用廣泛，實驗研究亦發(fā)現(xiàn)其具有促進創(chuàng)面微循環(huán)、血管新生、肉芽生長、膠原合成、上皮生長及調(diào)控局部成纖維細胞生長因子水平等作用。明膠海綿作為止血的體內(nèi)植入藥物長期運用于臨床，安全性高，無毒副作用，其主要成分是膠原，經(jīng)過修飾后可以提高組織相容性及促進血管生成。我們前期[1]對生肌玉紅膏載入修飾后明膠海綿發(fā)現(xiàn)其促進創(chuàng)面肉芽生長的機理之一是促進血管生成及改善創(chuàng)面微循環(huán)。本文將觀察生肌玉紅明膠海綿對創(chuàng)面愈合率、肉芽組織中bGFG陽性細胞數(shù)、Ⅰ、Ⅲ膠原含量、羥脯氨酸含量的影響，進一步探討其生肌作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器 明膠海綿；生肌玉紅紗布；凡士林紗布；即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑盒；DAB顯色試劑；CollagenⅠ、CollagenⅢ；b-FGF試劑盒；羥脯氨酸測試盒；756PA紫外可見光光度計；光學顯微鏡等。

1.2 藥物來源及制劑加工 生肌玉紅明膠海綿的制備流程:以生肌玉紅膏主要藥物組成(當歸、紫草、血竭、白臘、白芷、甘草，去除輕粉 )20 g劑量均勻攪拌于肝素修飾后的明膠海綿膠原中，接著行低溫(-20 ℃)凍干形成生肌玉紅明膠海綿。

生肌玉紅明膠海綿消毒：制作好的生肌玉紅明膠海綿裝玻璃器皿密封后，予鈷60-γ射線輻照，每周消毒1次，輻照標準參照1997年衛(wèi)生部發(fā)布《60Co中藥滅菌標準》(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院原子能研究所提供)。

1.3 動物分組及給藥 實驗動物及造模方法：選取SD大鼠40只(200～250 g)雌雄各半，參照付小兵全層皮膚缺損法制成動物體表潰瘍模型。實驗分組及給藥方法:將大鼠隨機分為4組:凡士林對照組(F組)10只、生肌玉紅膏組(S組)10只、修飾后明膠海綿組(M組)10只、生肌玉紅明膠海綿組(SM組)10只。創(chuàng)傷模型制成后，醫(yī)用碘伏消毒創(chuàng)面,在F組大鼠的創(chuàng)面上敷凡士林紗條并用無菌敷料包扎創(chuàng)面；S組大鼠的創(chuàng)面上敷生肌玉紅膏后再予無菌敷料包扎創(chuàng)面；M組大鼠的創(chuàng)面上敷明膠海綿后再用無菌敷料包扎創(chuàng)面；SM組大鼠的創(chuàng)面上敷生肌玉紅明膠海綿后再予無菌敷料包扎創(chuàng)面。每組均為隔日換藥1次。

1.4 觀察指標與檢測方法

1.4.1 大體指標 創(chuàng)面愈合率:造模后第3、7、14天用數(shù)碼相機對創(chuàng)面照相，拍攝時鏡面與創(chuàng)面保持平行，鏡面距創(chuàng)面約15 cm,并在創(chuàng)面邊緣放一刻度尺，拍照后將照片存入電腦，記錄拍照日期及分組情況，用Image J軟件利用測定像素比例測出創(chuàng)面面積。

1.4.2 病理指標 Ⅰ、Ⅲ膠原含量、bFGF陽性細胞數(shù):取造模后第3、7、14天創(chuàng)面中心肉芽組織，石蠟固定后，與創(chuàng)面肉芽平行方向切片,行HE染色后，采用MaxVisionTM即用型快速免疫組化一步法測定。

Ⅰ、Ⅲ膠原以有棕黃色染者為陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照，染色結果應用Image2 Pro Plus 4.1版本計算機圖像分析系統(tǒng)在顯微鏡下計算區(qū)域的陽性面積百分比(%)，求出5個視野平均值，實驗結果以細胞及基質(zhì)顯色面積為標準。

bFGF免疫組化標記定位于細胞漿，以細胞漿著色呈棕黃色為陽性細胞。目鏡為10倍，物鏡為20倍的條件下，采用雙盲法，由2個觀察者對各組標本每個切片隨機選取5個視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)及總細胞數(shù)，并計算陽性細胞率。

1.4.3 生化指標 羥脯氨酸含量:采用樣本堿水解法，將創(chuàng)面肉芽取出稱重后，予以勻漿后離心，加入試劑后，以分光光度儀測定其吸收值。

2 結果

2.1 各組創(chuàng)面愈合率比較 見表1。

表1 各組創(chuàng)面不同時間愈合率(±s) %

2.2 bFGF免疫組化標記結果 見圖1，圖2。

注:柱狀圖形為各組創(chuàng)面肉芽內(nèi)bFGF陽性細胞百分比的均數(shù)，誤差線為各組標準差(下同)。與凡士林組比較，#P<0.05或0.01；與生肌玉紅膏組比較，△P<0.05或0.01。

圖2 大鼠肉芽第7天bFGF免疫組化照片(×200倍)

2.3 大鼠創(chuàng)面肉芽中Ⅰ型膠原結果 見圖3，圖4。

注：與凡士林組比較，#P<0.05或0.01;與生肌玉紅膏組比較，△P<0.05或0.01。

圖4 大鼠肉芽第7天Ⅰ型膠原免疫組化照片(×200倍)

2.4 創(chuàng)面肉芽中Ⅲ型膠原含量 見圖5，圖6。

注:與凡士林組比較，#P<0.05或0.01；與生肌玉紅膏組比較，△P<0.05或0.01。

圖6 大鼠肉芽第14天Ⅲ型膠原免疫組化照片(×100倍)

2.5 各組創(chuàng)面肉芽內(nèi)羥脯氨酸含量 見表2。

表2 各組創(chuàng)面肉芽組織中羥脯氨酸含量(±s) μg/mg

3 討論

膠原，尤其是Ⅰ型膠原，是生物體各種結締組織的主要組成，具有促進組織愈合、可體內(nèi)降解且降解碎片具有組織相容性的特性，同時經(jīng)過修飾后可以提高組織相容性及促進血管生成，已成為組織工程中應用最廣的生物材料[2]。明膠是膠原經(jīng)溫和斷裂后的產(chǎn)物，它與膠原具有相同的化學組成，保留了膠原大部分的優(yōu)良理化性能。

通過將生肌玉紅膏載入修飾后明膠海綿，明膠海綿中的肝素隨著明膠的降解進入創(chuàng)面，與組織中的促血管生成生長因子發(fā)生生理性結合，提高其促血管生成的療效[3]，新生的血管為纖維的包裹提供了良好的支架，同時為肉芽的生長提供了良好的血運。造模后第3、7天，各組bFGF含量均呈逐漸上升的趨勢，實驗組bFGF陽性細胞數(shù)顯著高于控制組，而生肌玉紅明膠海綿組顯著高于生肌玉紅膏組及明膠海綿組。內(nèi)源性bFGF表達增加，不僅可通過趨化作用使單核細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等向損傷部位聚集，減輕炎癥反應，同時能促進血管和肉芽組織的生成，促進軟組織和骨組織中各種與損傷修復重建有關的細胞分裂增殖[4]。因此在創(chuàng)傷修復炎癥期及增殖期，經(jīng)肝素修飾后的明膠海綿能刺激血管生成，加速肉芽的生長，其療效和生肌玉紅膏相似，生肌玉紅明膠海綿的療效又好于二者。造模后第14天，各組bFGF含量下降，且生肌玉紅明膠海綿組及生肌玉紅膏組顯著低于對照組。既往研究[1，5]結果顯示：生肌玉紅明膠海綿在創(chuàng)傷初期肉芽內(nèi)VEGF含量升高，而后期VEGF含量稍下降；生肌玉紅膏能在創(chuàng)傷修復各期調(diào)節(jié)局部組織中成纖維細胞生長因子，均與本次實驗結果一致。

在創(chuàng)面愈合過程中，Ⅰ、Ⅲ型膠原起著重要作用[6]。Ⅲ型膠原比例高低與瘢痕的形成及質(zhì)量好壞密切相關。創(chuàng)傷形成后，纖維細胞增生，促進纖維形成，以填補組織缺損，因此造模后第3、7天，實驗各組Ⅰ、Ⅲ型膠原均顯著增生，Ⅰ型膠原以生肌玉紅明膠海綿增生顯著，高于其他2個實驗組；而Ⅲ型膠原作為新生膠原，增生活躍，故各組第3天無統(tǒng)計學差異，而第7天各實驗組與控制組達到顯著差異。在創(chuàng)傷修復塑性期,生肌玉紅明膠海綿組Ⅰ型膠原稍下降，而Ⅲ型膠原含量仍維持較高水平，這對于降低Ⅰ、Ⅲ膠原比例，減少瘢痕的形成，提高創(chuàng)傷修復質(zhì)量有重要意義。

羥脯氨酸(OHP)多見于膠原內(nèi),是膠原蛋白的主要而恒定的成分，一般以羥脯氨酸含量的7.46倍代表膠原的量[7]，因此，通過測定OHP的含量可間接反應膠原的含量,了解創(chuàng)面愈合過程中膠原代謝狀況。造模后，各組創(chuàng)面肉芽中羥脯氨酸含量逐漸升高，至第14天達到峰值，且生肌玉紅明膠海綿組羥脯氨酸含量在各期均顯著高于控制組，第14天時與生肌玉紅膏組達到顯著性差異，說明生肌玉紅明膠海綿在促進膠原合成方面優(yōu)于生肌玉紅膏，能快速填補組織缺損，提高愈合率。

總之，通過本實驗，我們認為，生肌玉紅明膠海綿生肌作用的機理主要是通過bFGF介導的。膠原的更新過程主要依賴膠原酶的作用，膠原酶主要是成纖維細胞產(chǎn)生，而bFGF正是成纖維細胞的趨向劑和有力的生長刺激劑。創(chuàng)傷初期，生肌玉紅明膠海綿通過提高創(chuàng)面內(nèi)源性bFGF含量，促進血管新生，趨化炎性細胞減輕炎癥反應，刺激成纖維細胞增生、合成纖維和基質(zhì)，增生的毛細血管、纖維和基質(zhì)共同形成肉芽組織，填充缺損，有利于周圍上皮組織的爬行，促進創(chuàng)面愈合。在創(chuàng)面塑性期，通過下調(diào)bFGF水平，促進過度增生膠原降解，使其排列有序，減少瘢痕形成。而生肌玉紅明膠海綿的多孔特性，使其具有良好的親水性，敷于創(chuàng)面后吸濕性好，及時排出創(chuàng)面滲出，也為肉芽的生長提供了良好的環(huán)境。

[1]姚昶,孫海艦,姚涌暉,等.生肌玉紅明膠海綿促進機械性創(chuàng)面肉芽生長的實驗研究[J].醫(yī)學研究雜志,2009,38(5):62-65.

[2]HUTMACHER D L,HURZELER M B.A tissue engineered cell-occlusive device for hard tissue regeneration--a preliminary report[J].The International Journal of Periodontics & Restorative Dentistry,2001,21:49-59.

[3]YAO C,NOAH E M,STEFFENS G M,et al.The effect of crosslinking of collagen matrices on their angiogenic capability[J].Biomaterials,2008(29):66-74.

[4]CHUA K-h,AMINUDDIN B S,FUZINA N H,et al.Basic fibroblast growth factor with human serum supplementation:enhancement of human chondrocyte proliferation and promotion of cartilage regeneration[J].Singapore Medical Journal,2007,48(4):324-332.

[5]姚昶,潘立群.生肌玉紅膏對創(chuàng)面堿性成纖維生長因子含量影響的實驗研究[J].江蘇中醫(yī),1999,20(8):42.

[6]VISHWANATH M,MA Lisha,OTEY C A,et al.Modulation of corneal fibroblast contractility within fibrillar collagen matrices[J].Investigative Ophthalmology & Visual Science,2003,44(11):4724-4735.

[7]李震,李祝,房秋寒,等.中藥抗皮膚衰老劑對小鼠皮膚羥脯氨酸含量的影響[J].山東中醫(yī)藥大學學報,1997,21(2):142-143.