馮志國　劉慧娟　李濤　陳正望

摘要：為了研究ＳＫ６６的抗菌機(jī)制，對(duì)Ｋ６６－ｈｉｓ、ＡＭＡ－ＳＫ６６、Ｔｒｘ－ＳＫ６６進(jìn)行序列比對(duì)和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ｔｒｘ－ＳＫ６６是ＳＫ６６的氮端加了１個(gè)Ｔｒｘ蛋白，ＡＭＡ－ＳＫ６６是ＳＫ６６的氮端加了２個(gè)丙氨酸和１個(gè)甲硫氨酸，ＳＫ６６－ｈｉｓ是在ＳＫ６６的碳端加了６個(gè)組氨酸；比較ＳＫ６６－ｈｉｓ、ＡＭＡ－ＳＫ６６和Ｔｒｘ－ＳＫ６６殺滅細(xì)菌活性，結(jié)果表明Ｔｒｘ－ＳＫ６６沒有殺菌活性，ＡＭＡ－ＳＫ６６殺菌活性大大降低。試驗(yàn)結(jié)果說明氮端氨基酸對(duì)ＳＫ６６殺菌活性很重要，尤其氮端氨基酸的極性。

關(guān)鍵詞：抗菌肽ＳＫ６６；果蠅；富甘氨酸抗菌肽；抗菌機(jī)制

中圖分類號(hào)：Ｑ７８ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）24－5662-03

昆蟲不具備特異性免疫系統(tǒng)，其利用自身產(chǎn)生的各種昆蟲抗菌肽來應(yīng)對(duì)損傷和感染［１］。昆蟲抗菌肽種類繁多，不同抗菌肽的作用機(jī)制不同。根據(jù)抗菌肽作用于細(xì)胞部位的不同，可以將其大體分為兩類，一類是直接作用于微生物細(xì)胞膜的殺傷模式，抗菌肽首先通過靜電結(jié)合被吸引到細(xì)胞表面，到達(dá)質(zhì)膜后與脂質(zhì)雙分子層相互作用。目前已提出桶－板模型［１］、毯式模型［２］、環(huán)形孔模型［３］等多種模式來解釋抗菌肽的膜穿透活性。另一類為作用于靶點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)殺傷模式?？咕谋晦D(zhuǎn)入胞漿，能夠通過改變質(zhì)膜隔膜形成、抑制細(xì)胞壁合成、抑制核酸合成、抑制蛋白質(zhì)合成或抑制酶活性以達(dá)到殺菌的目的［４］。

富含甘氨酸（Ｇｌｙ）的抗菌肽的共同特點(diǎn)是一級(jí)結(jié)構(gòu)中含甘氨酸，有些是全序中富含甘氨酸［５］，如鞘翅肽（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒｉｃｉｎ）、半翅肽（Ｈｅｍｉｐｔｅｒｉｃｉｎ），有些是某一結(jié)構(gòu)域中富含甘氨酸［６］，如雙翅肽（Ｄｉｐｔｅｒｉｃｉｎ）、麻蠅毒素Ⅱ（ＳａｒｃｏｔｏｘｉｎⅡ）、凝集素（Ａｔｔａｃｉｎ）等，都至少有１個(gè)富含甘氨酸的結(jié)構(gòu)域。果蠅抗菌肽ＳＫ６６結(jié)構(gòu)域中富含甘氨酸［７－１０］，試驗(yàn)通過對(duì)ＳＫ６６－ｈｉｓ、ＡＭＡ－ＳＫ６６和Ｔｒｘ－ＳＫ６６的殺菌活性比較，試圖為富甘氨酸抗菌肽ＳＫ６６的抗菌機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。

１ 材料與方法

１．１ 材料

蘇云金芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｇ＋），華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；金黃色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ，Ｇ＋）、大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，Ｇ－）、枯草桿菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｇ＋）、銅綠假單胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｇ－）由華中科技大學(xué)校醫(yī)院提供。

ＳＫ６６－ｈｉｓ、ＡＭＡ－ＳＫ６６、Ｔｒｘ－ＳＫ６６為華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子生物物理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

１．２ 方法

１．２．１ 功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測 用ＤＮＡｍａｎ和ＧｅｎｅＣａｒｄ軟件進(jìn)行ＣＧ１３５５１序列分析并進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測。

１．２．２ 最低殺菌濃度（ＭＢＣ）測定 采用微量液體檢測法，參照最低抑菌濃度測定法改進(jìn)。待測樣品溶于無菌生理鹽水，并作系列二倍稀釋。將培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長期的待測菌用無菌生理鹽水稀釋，調(diào)整菌液為２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ，將此菌液與等體積的抗菌肽樣品溶液混合均勻，對(duì)照為無菌生理鹽水。３７℃保溫６０ｍｉｎ后?。处蹋厅c(diǎn)種于空白培養(yǎng)基上，室溫放置３０ｍｉｎ后３７℃倒置培養(yǎng)過夜后觀察。以沒有長出菌落的對(duì)應(yīng)樣品的終濃度為該樣品對(duì)該菌的最低殺菌濃度。當(dāng)對(duì)照組長出密集菌落５ｈ后，樣品組只長出少量菌落的則認(rèn)為該樣品有抑菌能力。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 富甘氨酸抗菌肽ＳＫ６６氨基酸序列比對(duì)和分析

３ 小結(jié)與討論

果蠅作為模式生物對(duì)研究動(dòng)物免疫起了重要作用。目前在黑腹果蠅體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)了８種抗菌肽，分別為樗蠶素［５］、天蠶素（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ）［６］、防御素（Ｄｅｆｅｎｓｉｎ）［７］、果蠅抗真菌肽（Ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ）［５］、果蠅肽（Ｄｏｒｓｏｃｉｎ）［５］、雙翅肽［１１］、碧蝽金屬肽（Ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｗｉｎ）［１２］和在雄性果蠅的射精囊中特異表達(dá)的Ａｎｄｒｏｐｉｎ［１３］，這些抗菌肽對(duì)特定微生物有較強(qiáng)的殺菌作用。

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