劉麗瓊，聶 奎*，余 姣，廖鑫凱

（1．西南大學動物科技學院，重慶 400715；2．廣安區(qū)畜牧食品局，四川 廣安 638000）

炎癥是機體的一種非特異性防御和消滅病原微生物的積極方式，屬于固有免疫的一種特殊形式，同時也是一個病理過程。但當機體免疫功能出現紊亂時，各種免疫細胞將分泌超量促炎細胞因子，產生“細胞因子風暴”而導致動物死亡，易造成腦炎、肺炎、腸炎等全身各個器官的炎癥反應，最終導致動物死亡。因此，了解炎癥發(fā)生的分子機制對研發(fā)新的抗炎中（獸）藥以及有效防治動物炎性疾病都具有重要意義。研究表明，在機體發(fā)生炎性反應的固有免疫反應應答中，Toll樣受體（TLRs）扮演著重要角色。TLRs識別外源性配體或內源性分子后，將識別信號傳遞給MyD88接頭蛋白，MyD88再將該信號傳遞給核因子－кB（NF－кB）并引起NF－кB活化，進而誘導炎癥因子的表達來參與炎癥反應[1]。但在炎癥反應過程中TLRs/MyD88通路相關分子的關系尚不清楚。本試驗采用Real－time RT－PCR方法研究TLR2、TLR4及其下游MyD88依賴的免疫信號通路的關鍵分子在小鼠感染急性結腸炎前后多個時段結腸組織中的轉錄水平，旨在了解固有免疫分子在炎癥中的作用及抗炎機制，為研發(fā)新型抗炎中藥提供參考。

1 試驗材料

1.1 試驗動物

6～7周齡的SPF級昆明小鼠30只，購于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心（許可證編號為SCXK渝2007－0002），雌雄各半，體重為25±2 g，試驗組24只，對照組6只。

1.2 主要試劑及儀器

2,4,6－三硝基苯磺酸（TNBS）購自 Sigma公司；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit、Ex Taq DNA聚合酶、SYBR?Primix Ex TaqTMⅡ均購自TaKaRa公司。Mini Opticon Real Time PCR儀由美國Bio－Rad公司生產。

2 試驗方法

2.1 建立小鼠急性結腸炎模型

將24只小鼠適應性飼養(yǎng)1周，禁食24 h，用乙醚將其輕度麻醉，再用涂有液體石蠟直徑為2 mm的自制灌腸器經肛門緩慢插入結腸處約4 cm，灌注2．5%的TNBS乙醇溶液5 mL·kg－1，捏緊肛門并倒提5 min，蘇醒后常規(guī)飼養(yǎng)。其余6只作陰性對照。在造模前、造模后1、3、5、7 d分別處死6只小鼠，無菌采取結腸組織，并迅速保存于液氮。

2.2 引物設計與合成

根據GenBank收錄的小鼠（Mus musculus）TLR2、TLR4、MyD88、NF－κB、TNF－α、IL－10和 β－actin的mRNA序列，利用Primer Premier 5．0和Oligo 6．0軟件分別設計一對引物，并用NCBI的在線軟件primer－blast分析各引物的特異性，引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成。TLR2、TLR4等基因的Real－time PCR引物見附表。

2.3 總RNA的提取和cDNA的合成

按RNAiso Plus提取試劑盒說明書提取結腸組織總RNA，并反轉錄成cDNA。反轉錄體系為：5×PrimeScript?Buffer 2 μL，PrimeScript?RT Enzyme MixⅠ0．5 μL，Oligo dT Primer（50 μM）0．5 μL，Ran?dom 6 mers（100 μM）0．5 μL， Total RNA 2 μL，RNase Free dH2O up to 10μL。反轉錄條件如下：37℃15 min，85℃5 sec。反轉錄產物置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 PCR擴增各基因片段

在25μL的PCR反應體系中，加入10×Ex Taq buffer（Mg2+Free）2．5 μL，dNTP Mixture（各 2．5 mM）0．5μL，MgCl2（25 mM）1μL，上下游引物（20μM）各0．5 μL，Ex Taq DNA聚合酶0．25 μL，cDNA 2μL，滅菌ddH2O加至25μL。PCR擴增程序為：94℃預變性 5 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

2.5 建立熒光定量PCR方法

紫外分光光度儀測定TLR2、TLR4、MyD88、NF－κB、TNF－α、IL－10和 β－actin PCR 產物的濃度，用EASY Dilution將各PCR產物作10倍梯度稀釋，并以此作為模板進行熒光定量PCR擴增，建立標準曲線。20μL反應體系：SYBR?Premix ExTaqTMⅡ(2×)10μL，上下游引物（20μM）各0．4μL，DNA模板2．0 μL，滅菌ddH2O 7．2 μL。熒光定量PCR反應條件為：95℃預變性20 s；95℃5 s，60℃30 s，40個循環(huán)；Dissociation stage。然后進行融解曲線、標準曲線分析。

附表 TLR2、TLR4等基因的Real-time PCR引物

2.6 結腸炎小鼠結腸組織TLR2、4/MyD88信號途徑相關分子mRNA表達量的檢測

按2．3方法對造模前、造模后1、3、5、7 d的結腸組織進行RNA提取并反轉錄成cDNA。以cD?NA為檢測模板，參照2．5的反應體系和反應條件檢測 各 時 段 TLR2、 TLR4、 MyD88、 NF－κB、TNF－α、IL－10和β－actin mRNA的表達量。

2.7 數據處理

采用2－△△Ct方法分析試驗數據，首先算出小鼠目的基因與內參基因β－actin的Ct差值（△Ct=△Ct目的基因－△Ctβ－actin），然后以小鼠造模前結腸組織的△Ct值為對照，用造模后4個時段的△Ct值減去造模前結腸組織的△Ct值即為△△Ct值，最后轉化為相對差異倍數即QR=2－△△Ct[2]。

3 試驗結果

3.1 小鼠結腸組織的總RNA提取

總RNA的提取結果見圖1。

由圖1可知，提取小鼠結腸組織的總RNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳，可見總RNA的特征性條帶，由上至下依次為28S、18S及5S，見圖1。

圖1 小鼠結腸總RNA的瓊脂糖凝膠電泳

3.2 TLR2、TLR4、MyD88等mRNAs的RT－PCR擴增

小鼠結腸各基因RT－PCR擴增結果見圖2。

圖2 小鼠結腸各基因RT-PCR擴增

由圖2可知，以小鼠結腸組織為原料，進行TLR2、TLR4、MyD88、NF－κB、TNF－α、IL－10和β－actin的RT－PCR擴增反應，各PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，可見與預期大小相符的單一目的條帶。

3.3 TLR2、TLR4、MyD88等目的基因的融解曲線和標準曲線分析

通過融解曲線分析可知，TLR2、TLR4、MyD88、NF－κB、TNF－α、IL－10和管家基因 β－actin的融解溫度分別為 82．0、83．5、85．5、87．5、82．0、78 和85．5℃，7個基因的融解曲線均為單峰，無雜峰和引物二聚體，說明PCR反應特異性好。標準曲線的擴增效率E值和相關系數R2值顯示，TLR2（E=99．1%，R2=0．998），TLR4（E=99．0%，R2=0．997），MyD88（E=97．6%，R2=0．998），NF－κB（E=102．0%，R2=0．997），TNF－α（E=97．6%，R2=0．998），IL－10（E=100．2% ， R2=0．997）， β－actin（E=92．8% ， R2=0．999）。

3.4 結腸炎小鼠結腸組織TLR2、4/MyD88通路相關分子mRNA的表達

結腸炎小鼠結腸組織TLR2、4/MyD88通路相關分子mRNA的表達見圖3。

圖3 TLR2、4/MyD88通路相關分子在小鼠感染結腸炎前后5個時段的相對表達量

由圖3可知，試驗數據經SPSS 15．0分析后發(fā)現，TLR2 mRNA在造模后3、5 d的表達量與造模前的表達量均呈顯著差異（P＜0．05），造模后7 d的表達量與造模前呈極顯著差異（P＜0．001）；TLR4 mRNA造模后1 d的表達水平顯著高于造模前（P＜0．05），造模后3、5、7 d的表達水平與造模前的差異為極顯著（P＜0．001）；MyD88在造模5、7 d的表達量與造模前相比具有顯著差異（P＜0．05）；NF－κB mRNA的分析結果同MyD88；TNF－α在造模后的mRNA表達量顯著高于造模前（除造模1 d外）（P＜0．01）；IL－10在造模后1、3 d的mRNA表達量與造模前具有顯著差異（P＜0．01），在造模后5、7 d的mRNA表達量與造模前差異不顯著（P＞0．05）。

4 討論

Ruslan等提出的模式識別受體理論表明，機體固有免疫不是簡單機械的應答外界刺激的一種低等應答形式，而是通過模式識別受體（PPRs）識別病原相關分子模式（PAMPs）而觸發(fā)[3]。對PRRs的研究最多的是位于細胞表面或內涵體上的TLRs，其起到信號傳遞的作用，在免疫應答的誘導和炎性反應中發(fā)揮重要作用，通過MyD88依賴型信號通路和TRIF依賴型信號通路來激發(fā)固有免疫反應，而MyD88依賴信號通路是介導機體炎性固有免疫反應的主要途徑。TLRs識別PAMPs后，通過胞內區(qū)的TIR結構域與MyD88 C端的TIR結構域結合將該信號傳遞給MyD88，MyD88 N端的死亡結構域又通過募集下游含死亡結構域的信號分子使信號向下傳遞，激活NF－кB，促進多種促炎細胞因子如IL－1β、IL－6、TNF－α等基因的轉錄和表達，抑制抑炎因子如IL－4、IL－10的表達，引發(fā)炎癥反應。

本試驗采用實時熒光定量RT－PCR法對結腸炎小鼠結腸組織TLR2、TLR4及其下游MyD88、NF－кB、TNF－α、IL－10 mRNA表達情況進行了檢測。在造模后1 d，小鼠結腸組織的TLR2和TLR4表達比造模前顯著增強，推測此時機體可能通過上調TLR2、TLR4的表達來激活下游信號分子，進而激發(fā)免疫應答。在造模后3、5、7 d，TLR2、TLR4的mRNA上調更為明顯，第7天達到頂峰，提示機體免疫應答反應呈增加趨勢，與程曉磊等采用RT－PCR方法研究結腸炎大鼠結腸中TLR2/4基因表達顯著高于正常大鼠的結果類似[4]。董六一等用克雷伯桿菌接種大鼠后，肺組織MyD88 mRNA與TLR2/4轉錄水平呈正相關，均出現高表達[5]。而本試驗中，MyD88在造模后1、3 d的表達略有增強，但在5、7 d異常高表達，表明MyD88也參與小鼠結腸炎的發(fā)病。NF－кB在造模后1 d開始出現上調，在造模后5 d相對表達量最高，顯著高于造模前（P＜0．05）。此結果與張超賢報道的NF－кB mRNA在潰瘍性結腸炎大鼠體內表達量與正常大鼠無顯著差異（P＞0．05）不相同[6]。推測可能由于種屬差異、檢測方法不同等原因導致結果出現偏差。TNF－α和IL－10分別是促炎細胞因子和抑炎細胞因子，二者在炎癥反應中的表達成負相關性。IL－10 mRNA在結腸炎小鼠腸上皮細胞中的表達量低，但高于正常小鼠。此次試驗結果也表明了TNF－α與IL－10的動態(tài)變化關系，與前學者的研究結果相符。

5 小 結

在機體發(fā)生炎性反應的固有免疫應答中，TLR2、4能通過MyD88依賴信號通路來激發(fā)應答反應。因此，在動物炎性疾病的防治方面，可考慮通過阻斷TLRs、MyD88、NF－кB等節(jié)點分子的信號傳遞研發(fā)抗炎藥物。

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[3]Ruslan M,Charles A,Janeway Jr．How does the immune system distinguish self from nonself[J]．Seminars in Immunology,2000,12:185－188．

[4] 程曉磊,杜立陽,劉清芳,等．復方青黛顆粒對潰瘍性結腸炎模型大鼠結腸toll樣受體2,4基因表達的影響[J]．中國中西醫(yī)結合消化雜志,2011,19（1）:14－17．

[5] 董六一,汪春彥,吳常青,等．金蕎麥對克雷伯桿菌肺炎大鼠肺組織中TLR2/4,MyD88 mRNA和IκB－α表達的影響[J]．中國中藥雜志,2011,36（2）:200－204．

[6] 張超賢,郭李柯,郭曉鳳．潰瘍性結腸炎模型大鼠NF－κB活性、NF－κB mRNA及TNF－αmRNA的表達及芪倍合劑的干預作用[J]．西安交通大學學報,2011,32（3）:319－323．