馬 濤， 陸肖瑋， 丁 云

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)被認(rèn)為是一種獨(dú)立的臨床病理類型，具有侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差的特點(diǎn)，已經(jīng)成為國際上乳腺癌研究的新熱點(diǎn)。研究證實(shí)COX-2和VEGF在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用，本研究通過免疫組化的方法分析COX-2和VEGF在三陰性乳腺癌的表達(dá)情況，并與非三陰性乳腺癌的表達(dá)情況進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)他們?cè)谌幮匀橄侔┲械囊饬x。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源 收集我院2006年1月到2009年12月行乳腺癌根治術(shù)的219例癌組織標(biāo)本，術(shù)前均未行放化療。根據(jù)我院免疫組化結(jié)果，ER和PR陽性是指免疫組化染色陽性細(xì)胞在10%以上者，HER2根據(jù)《乳腺癌 HER2檢測指南》標(biāo)準(zhǔn)［1］，－ ～+為陰性，+++者陽性，++者再用色素原位雜交法進(jìn)行驗(yàn)證。其中三陰性乳腺癌42例，平均年齡53.5歲;非三陰性乳腺癌177例，平均年齡59.3歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 COX-2、VEGF、D2-40的檢測應(yīng)用免疫組化S-P法，鼠抗人COX-2單克隆抗體、鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人D2-40單克隆抗體均購自Santa Cruz公司，SP試劑盒購自北京中山公司。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)時(shí)用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知的結(jié)腸癌 COX-2、VEGF陽性片和D2-40陽性表達(dá)的扁桃體組織切片作陽性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) COX-2和VEGF陽性染色主要定位于細(xì)胞漿。將乳腺癌組織標(biāo)本脫水固定，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色(鏈霉菌抗生物素蛋白——過氧化酶-SP)法檢測，用已知的陽性組織切片做陽性對(duì)照，用PBS作陰性對(duì)照，用DAB染色。胞漿棕黃色顆粒沉著的為陽性細(xì)胞。讀片時(shí)每張切片分別取上、下、左、右及中心共5個(gè)區(qū)域的細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)區(qū)計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞，共計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算染色細(xì)胞所占比例，陽性細(xì)胞＜10%為表達(dá)陰性，≥10%為表達(dá)陽性，不考慮染色的強(qiáng)度。

淋巴管密度(lymph vessel density，LVD)的計(jì)數(shù)按參考文獻(xiàn)［2］:D2-40染色棕黃色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇為1個(gè)淋巴管計(jì)數(shù)，首先在低倍鏡下選擇淋巴管密度最高的區(qū)域，然后在200倍光鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野內(nèi)淋巴管數(shù)，再求其平均值。D2-40染色陽性的管腔內(nèi)見到至少一個(gè)癌細(xì)胞就判斷為淋巴管浸潤(lymph vessel invasion，LVI)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)比較應(yīng)用 t檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三陰性和非三陰性乳腺癌COX-2和VEGF的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系(表1) 本組219例乳腺癌標(biāo)本中42例為三陰性乳腺癌，占19.2%，非三陰性乳腺癌177例，占80.8%。42例三陰性乳腺癌標(biāo)本中COX-2的陽性表達(dá)率為66.7%(28/42)，VEGF的陽性表達(dá)率為59.5%(25/42)，與患者的發(fā)病年齡、腫瘤大小、病理類型和臨床分期無相關(guān)性(P＞0.05)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤有關(guān)(P＜0.05)。177例非三陰性乳腺癌COX-2陽性表達(dá)率為52.0%(92/177)，VEGF 的陽性表達(dá)率為 40.7%(72/177)，同樣與患者發(fā)病年齡、腫瘤大小、病理類型及臨床分期無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤有關(guān)(P＜0.05)。

表1 三陰性與非三陰性乳腺癌病理特點(diǎn)及COX-2和VEGF的表達(dá)

2.2 三陰性和非三陰性乳腺癌COX-2和VEGF表達(dá)與淋巴管密度的關(guān)系(表2)COX-2和VEGF的陽性表達(dá)在三陰性和非三陰性乳腺癌中都與淋巴管密度相關(guān)，COX-2陽性組淋巴管密度明顯高于COX-2陰性組;VEGF陽性組淋巴管密度亦明顯高于VEGF陰性組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。但在三陰性乳腺癌同非三陰性乳腺癌之間，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

表2 三陰性與非三陰性乳腺癌COX-2、VEGF表達(dá)與淋巴管密度的關(guān)系±s，支/mm2)

表2 三陰性與非三陰性乳腺癌COX-2、VEGF表達(dá)與淋巴管密度的關(guān)系±s，支/mm2)

COX-2+－P VEGF+－P 5.29 ＜0.05非三陰性乳腺癌 11.62±4.92 7.79±4.81 ＜0.05 12.79±5.54 8.51±三陰性乳腺癌 12.84±5.49 8.45±5.10 ＜0.05 14.14±5.68 9.65±5.25 ＜0.05

2.3 非三陰性乳腺癌 COX-2和 VEGF的表達(dá)與ER、PR和HER2表達(dá)的關(guān)系(表3) 在非三陰性乳腺癌中，COX-2和 VEGF的表達(dá)與 ER、PR和HER2的表達(dá)均無相關(guān)性(P＞0.05)。

表3 非三陰性乳腺癌COX-2、VEGF表達(dá)與ER、PR、HER2表達(dá)的相關(guān)性

2.4 三陰性乳腺癌中COX-2與VEGF表達(dá)之間的比較(表4)COX-2與VEGF具有相關(guān)性(P＜0.05)。

表4 三陰性乳腺癌COX-2與VEGF相關(guān)性

2.5 COX-2和VEGF在三陰性乳腺癌和非三陰性乳腺癌中的表達(dá)情況(表5)COX-2在三陰性乳腺癌的陽性表達(dá)率為66.7%，高于非三陰性乳腺癌的52.0%，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。VEGF在三陰性乳腺癌的陽性率為59.5%，在非三陰性乳腺癌的陽性率為40.7%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表5 三陰性乳腺癌與非三陰性乳腺癌COX-2和VEGF表達(dá)率的比較

3 討論

COX-2是一種膜結(jié)合蛋白酶，可能通過促進(jìn)新生血管生成、腫瘤細(xì)胞增殖、抑制凋亡、促進(jìn)播散潛能而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［3］。在乳腺癌患者中COX-2往往高表達(dá)，且與預(yù)后相關(guān)［4］。VEGF是一種特異性促使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的有絲分裂原，在多種實(shí)體惡性腫瘤中高表達(dá)，并且在惡性腫瘤的生長、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用［5］。本研究顯示，在三陰性乳腺癌中，COX-2和VEGF基因均有高表達(dá)，而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管密度和淋巴管浸潤有顯著相關(guān)性，與發(fā)病年齡、腫瘤大小、病理類型和臨床分期無明顯相關(guān)性。同時(shí)本研究結(jié)果還提示，COX-2基因和VEGF基因在三陰性乳腺癌中的表達(dá)具有顯著的相關(guān)性。這可能與COX-2與VEGF具有協(xié)同作用并共同參與一些病理、生理過程有關(guān)。有報(bào)道證實(shí)COX-2能通過上調(diào)VEGF的表達(dá)從而促進(jìn)血管的生成［6］。提示COX-2和VEGF的陽性表達(dá)在三陰性乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移方面起到一定的協(xié)同作用。

本研究中，COX-2在三陰性乳腺癌和非三陰性乳腺癌中均高表達(dá)，分別為66.7%和52.0%，且差異無顯著性。分析原因，可能由于COX-2是乳腺癌比較普遍的基因表達(dá)產(chǎn)物，參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的多個(gè)方面，因此在三陰性和非三陰性乳腺癌中均有較高表達(dá)。VEGF在三陰性乳腺癌中的陽性表達(dá)率(59.5%)顯著高于非三陰性乳腺癌的40.7%，這與Linderholm等［7］的報(bào)道相一致。說明VEGF與三陰性乳腺癌早期轉(zhuǎn)移等惡性行為的聯(lián)系更加緊密，VEGF的高表達(dá)更有意義。在非三陰性乳腺癌中，COX-2和VEGF基因的表達(dá)與ER、PR和HER2的表達(dá)無顯著相關(guān)性，與淋巴管密度和淋巴管浸潤相關(guān)，可能與三陰性乳腺癌的高局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率有關(guān)。

三陰性乳腺癌患者既不能接受ER、PR陽性的內(nèi)分泌治療，也不能接受針對(duì)HER2陽性的靶向治療，放化療就成為術(shù)后治療的主要手段。分子靶向治療成為了研究的熱點(diǎn)，但目前尚無標(biāo)準(zhǔn)的治療方案［8］。COX-2與VEGF在三陰性乳腺癌中高表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面有關(guān)，有望成為三陰性乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。

［1］《乳腺癌HER2檢測指南(2009版)》編寫組.乳腺癌HER2檢測指南(2009版)［J］.中華病理雜志，2009，38(12):836-842.

［2］Schoppmann SF，Bayer G，Aumayr K，et a1.Prognostic value of lymphangiogenesis and lymphovascular invasion in invasive breast cancer［J］.Ann Surg，2004，240:306-312.

［3］Solow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et a1.COX-2 is expressed in human pulmonary，colonic，and mammary tumors［J］.Cancer，2000，89(12):2637-2645.

［4］Miglietta A，Toselli M，Ravarino N，et al.COX-2 expression in human breast carcinomas:correlation with clinicopathological features and prognostic molecular markers［J］.Expert Opin Ther Targets，2010，14(7):655-664.

［5］LeeSJ，Lee SY，JeonEON HS，et a1.Vascular endothelial growth factor gene polymorphisms and risk of primary lung cancer［J］.Cancer Epidermal Biomarkers Prey，2005，14(3):571-575.

［6］Guo GL，Yang GL，Li ZY，et a1.The effect of cyclooxygenase-2 on lymphangiogenesis in breast cancer［J］.Zhonghua Wai Ke Za Zhi，2008，46(2):132-135.

［7］Linderholm BK，Hellborg H，Johansson U，et al.Significantly higher levels of vascular endothelial growth factor(VEGF)and shorter survival times for patients with primary operable triple-negative breast cancer［J］.Ann Oncol，2009，20(10):1639-1646.

［8］Freres P，Collignon J，Gennigens C，et al.“Triple negative”breast cancer［J］.Rev Med Liege，2010，65(3):120-126.