多菌種發(fā)酵青稞酒化學(xué)成分變化研究

曹 妍，杜木英,2,*，闞建全,2，陳宗道,2

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

多菌種發(fā)酵青稞酒化學(xué)成分變化研究

曹 妍1，杜木英1,2,*，闞建全1,2，陳宗道1,2

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

研究青稞酒多菌種曲發(fā)酵過程中化學(xué)成分的動態(tài)變化規(guī)律并與傳統(tǒng)曲發(fā)酵進行比較。結(jié)果表明：青稞酒的多菌種曲發(fā)酵過程中，表現(xiàn)出類似傳統(tǒng)曲發(fā)酵過程中各成分的動態(tài)變化趨勢。pH值明顯下降，之后穩(wěn)定在pH4.0～4.3；總酸含量隨著發(fā)酵時間延長顯著上升(P＜0.05)，發(fā)酵60h時達到最大值0.83g/100g，之后略有下降；發(fā)酵品溫先緩慢上升，再緩慢下降，最高達36.2℃左右；還原糖含量和糖化酶活力值都在24h內(nèi)顯著增加之后逐漸下降；總糖含量顯著下降，酒精體積分數(shù)顯著增高(P＜0.05)，多菌種曲發(fā)酵的酒精體積分數(shù)可達到10.30%，比傳統(tǒng)曲發(fā)酵提高57.73%；酒醅中酸性蛋白酶活力及氨態(tài)氮含量同時呈顯著性增高，24h后，蛋白酶活力及氨態(tài)氮含量逐漸降低；多菌種曲發(fā)酵的青稞酒總氨基酸含量80.923mg/100mL，缺乏蛋氨酸。感官評定表明風(fēng)味較好的多菌種青稞酒的發(fā)酵時間約為60～72h，并保持了傳統(tǒng)青稞酒的主體風(fēng)味。

青稞酒；多菌種發(fā)酵；化學(xué)成分

青稞，學(xué)名Hordeum vulgare L. var. nudum Hook.f.，又稱為裸大麥，元麥，裸麥，屬于禾本科植物，谷物中大麥的一類。青稞最早被殷墟甲骨文記載為“來”，后來被證實其為青稞[1]。青稞酒，藏語叫做“羌”，從古至今，一直是藏族人民最喜歡喝的酒。“菌種是發(fā)酵業(yè)的靈魂”，釀酒發(fā)酵中常用菌種有黃米曲霉、根霉、毛霉、紅曲霉、釀酒酵母、生香酵母等。藏曲是西藏人民按照自己的傳統(tǒng)自然接種方式制作而成的釀酒發(fā)酵劑的統(tǒng)稱。青稞酒的曲均為自然曲，曲中都含有根霉、毛霉、曲霉、酵母和產(chǎn)酸菌及其他雜菌[2]。與傳統(tǒng)的自然曲發(fā)酵相比，人工純化菌種，以多菌種曲進行發(fā)酵釀酒的相關(guān)報道較少。

青稞酒是一種具有民族特色的低度發(fā)酵酒，與目前市面上的黃酒、啤酒、清酒及米酒等有較大的差別，它除了具發(fā)酵酒特有的甜酸味外，還有濃郁的青稞酒特有的醇香味及混濁的體態(tài)。近年來，我國飲料酒工業(yè)發(fā)展迅速，但花色品種不多，各大酒業(yè)集團公司都在加大科技投入，研究換代產(chǎn)品。目前對黃酒等的研究已經(jīng)越來越深入[3-8]，國外對日本清酒、特色發(fā)酵酒的純種發(fā)酵研究也很多[9-12]。

本實驗利用在傳統(tǒng)青稞酒發(fā)酵過程中篩選并選育出的優(yōu)良菌株制成的多菌種曲進行青稞酒發(fā)酵實驗，以傳統(tǒng)優(yōu)良青稞酒曲發(fā)酵青稞酒作為對照，跟蹤整個發(fā)酵過程，研究青稞酒多菌種發(fā)酵過程中的各成分動態(tài)變化，為青稞酒工業(yè)化產(chǎn)品的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞、青稞酒傳統(tǒng)優(yōu)良酒曲 西藏拉薩；多菌種曲 實驗室自制的米根霉純種曲和酵母固體曲復(fù)配而成。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004A型電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；JJ-2(B)型組織搗碎勻漿機 上海標(biāo)本模型廠；PHS-3C+智能酸度計 成都方舟科技開發(fā)公司；722型分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；Kjeltec 2300自動凱氏定氮儀 丹麥Foss Tecator AB公司；CS101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；L-8800型全自動氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.3 青稞酒釀造工藝流程

1.3.1 傳統(tǒng)發(fā)酵青稞酒

青稞→浸泡→蒸煮→攤涼→拌入青稞酒傳統(tǒng)酒曲(酒曲加量為原料青稞質(zhì)量的0.4%～0.5%)→28～30℃糖化發(fā)酵72h→青稞酒醅→加涼開水浸泡4h以上→過濾→青稞酒

1.3.2 多菌種發(fā)酵青稞酒

酒曲用多菌種曲接種，加入量為原料青稞質(zhì)量的5%，其余步驟同傳統(tǒng)發(fā)酵。

1.3.3 取樣方法

分別進行多菌種曲發(fā)酵和傳統(tǒng)曲發(fā)酵，在發(fā)酵期間，每隔12h均勻取樣，用組織粉碎機粉碎，作為實驗的樣品。對照為經(jīng)蒸煮過的青稞，重復(fù)3次。

1.3.4 理化指標(biāo)的測定

pH值、總酸含量、氨態(tài)氮含量的測定方法參考文獻[13]；糖化酶活力、還原糖含量、總糖含量、酒精體積分數(shù)、酸性蛋白酶活力的測定方法參考文獻[14]；水分含量的測定方法參考文獻[15]；α-淀粉酶活性的測定方法參照文獻[16]。

1.3.5 青稞酒的感官評定

選擇10名經(jīng)過食品感官評定訓(xùn)練的具有豐富經(jīng)驗的師生參照表1的標(biāo)準進行色、香、味、格綜合打分評定，總分15分。

表1 感官評定標(biāo)準Table 1 Standards for sensory evaluation of highland barley wine

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有的實驗數(shù)據(jù)都是3次實驗的平均值，用Origin8.5軟件作圖，并用SPSS11.5進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵酒醅的pH值及總酸含量的變化

青稞酒發(fā)酵過程中發(fā)酵醪液的pH值與微生物的生長繁殖和代謝產(chǎn)物的積累有密切關(guān)系，是微生物在特定環(huán)境下代謝活動的綜合指標(biāo)，能夠判斷酒精發(fā)酵是否正常，是一項重要的發(fā)酵參數(shù)。青稞酒的總酸較之我國著名發(fā)酵酒黃酒，國外發(fā)酵酒如印度米酒等都高，說明青稞酒有不同于這些發(fā)酵酒的獨特環(huán)境和發(fā)酵基質(zhì)。

圖1 發(fā)酵酒醅pH值及總酸變化趨勢Fig.1 Changes of pH and acidity of highland barley during fermentation

由圖1可知，多菌種曲和傳統(tǒng)曲發(fā)酵pH值變化趨勢基本一致，0～24h期間pH值明顯降低，之后趨于平穩(wěn)，穩(wěn)定在4.0～4.3之間。說明24h內(nèi)微生物大量繁殖，快速進入產(chǎn)酸階段，產(chǎn)生大量有機酸。后酵期pH值較穩(wěn)定，可能是由于后期糖類物質(zhì)供應(yīng)不足，使生成的有機酸部分作為碳源被微生物利用消耗。

總酸含量是衡量發(fā)酵是否正常和酒質(zhì)優(yōu)劣的重要參數(shù)。多菌種曲發(fā)酵的酒醅總酸則隨著發(fā)酵時間延長顯著上升(P＜0.05)，發(fā)酵60h時達到最大值0.83g/100g，之后略有下降。統(tǒng)計分析表明，多菌種曲pH值與多菌種曲總酸含量之間呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)；而傳統(tǒng)曲pH值與總酸含量之間相關(guān)性不顯著(P＞0.05)。多菌種曲pH值與總酸相關(guān)性好說明醪液中酸的種類較少，酸較強，易于控制酒醅pH值和總酸，實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，并保證產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定。而傳統(tǒng)曲二者相關(guān)性差表明其中酸的種類多，這對于酒的風(fēng)味是有利的，后續(xù)研究應(yīng)篩選產(chǎn)風(fēng)味菌株增強青稞酒的風(fēng)味。

2.2 發(fā)酵過程中酒醅品溫的變化

圖2 發(fā)酵過程中酒醅品溫的變化Fig.2 Changes of temperature of highland barley during fermentation

溫度的變化能有效而且間接地反映出發(fā)酵狀況。適宜的品溫利于釀造微生物生長，使發(fā)酵順利進行。由圖2可知，多菌種曲和傳統(tǒng)曲的青稞酒醅在發(fā)酵過程中品溫均為先緩慢上升，到達最高溫度36.2℃后顯著下降(P＜0.05)，最后維持在28.1～30.0℃左右。前期降溫和淀粉降解速度小有很大關(guān)系[17]，之后品溫迅速提高，微生物進入旺盛的代謝時期，開始進行酒精發(fā)酵，溫度逐漸降低，最后溫度有所回升，可能是某些微生物又開始活動旺盛。微生物代謝產(chǎn)生呼吸熱，傳統(tǒng)曲在發(fā)酵的24h左右就升至36℃左右，可能是傳統(tǒng)曲中產(chǎn)酸微生物快速生長繁殖所致，所以傳統(tǒng)曲釀造的青稞酒的酸度較之同類型的發(fā)酵酒偏大。酒醅品溫“前期緩慢上升，后期緩慢下降”，符合微生物生長代謝的規(guī)律。

2.3 發(fā)酵過程中酒醅水分含量的變化

酒醅中霉菌酵母等微生物繁殖需要水分，糖化、發(fā)酵亦以水分作為媒介。在發(fā)酵過程中，如水分(總揮發(fā)物)不斷增加，則表明酒醅發(fā)酵越正常，越徹底。酒醅入池后溶氧存在于酒醅中，發(fā)酵過程中糖被分解，產(chǎn)生一定量的水分。由圖3可知，多菌種發(fā)酵的水分含量從發(fā)酵24h后就一直略高于傳統(tǒng)發(fā)酵，預(yù)示其發(fā)酵更為徹底，酒醅的水分含量在發(fā)酵過程中顯著增加(P＜0.05)，說明多菌種曲發(fā)酵進行正常。

圖3 發(fā)酵酒醅的水分含量變化趨勢Fig.3 Changes of water content of highland barley during fermentation

2.4 發(fā)酵過程中酒醅還原糖含量及糖化酶活力的變化

圖4 發(fā)酵酒醅還原糖含量及糖化酶活力變化趨勢Fig.4 Changes of reducing sugar content and glucoamylase activity of highland barley during fermentation

還原糖是青稞酒發(fā)酵過程中微生物直接利用的碳源物質(zhì)，發(fā)酵過程中的動態(tài)變化直接影響酒精的生成，反映了發(fā)酵中微生物利用碳源的情況，其變化微妙地反映了發(fā)酵過程的協(xié)調(diào)程度。由圖4可知，在0～24h內(nèi)，糖化酶活力及還原糖含量均顯著增加(P＜0.05)，因為根霉大量分泌糖化酶，還原糖含量逐步升高。24h后糖化酶活力逐漸降低，釀酒酵母利用還原糖進行酒精發(fā)酵，還原糖含量也隨之下降。多菌種曲還原糖含量與多菌種曲糖化酶活力之間呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，而傳統(tǒng)曲還原糖含量與傳統(tǒng)曲糖化酶活力相關(guān)性不顯著(P＞0.05)，再次證實了多菌種曲發(fā)酵的規(guī)律性和可控性。多菌種曲的酒醅殘?zhí)且驳陀趥鹘y(tǒng)曲發(fā)酵，說明多菌種曲發(fā)酵糖化力更強，發(fā)酵更徹底，有利于提高原料利用率。

2.5 發(fā)酵酒醅的酒精體積分數(shù)及總糖含量變化

圖5 發(fā)酵酒醅總糖含量及酒精體積分數(shù)變化趨勢Fig.5 Changes of total sugar content and alcohol volume fraction during fermentation

酒精是酒醅發(fā)酵的主要產(chǎn)物，含量多少是鑒定酒醅質(zhì)量的主要指標(biāo)，也是判斷發(fā)酵是否正常的重要依據(jù)。由圖5可知，在整個青稞酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵酒醅的酒精體積分數(shù)顯著性增高(P＜0.05)，總糖含量呈顯著性下降趨勢(P＜0.05)。當(dāng)發(fā)酵36h后，酒精體積分數(shù)趨于平穩(wěn)，是因為發(fā)酵進入了以產(chǎn)酸產(chǎn)酯為主的階段，酯化作用和呼吸作用都會消耗乙醇，所以酒精體積分數(shù)保持平穩(wěn)。多菌種曲酒精體積分數(shù)與多菌種曲總糖含量之間以及傳統(tǒng)曲酒精體積分數(shù)與傳統(tǒng)曲總糖含量都呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)。

多菌種曲發(fā)酵是本實驗室從傳統(tǒng)優(yōu)良青稞酒曲中選育的高產(chǎn)糖化酶菌株和耐酒精能力達14%的酵母分別制曲，混合發(fā)酵，酒醅酒精體積分數(shù)顯著提高，由傳統(tǒng)曲的產(chǎn)酒精體積分數(shù)6.53%提高到 10.30%，比傳統(tǒng)曲發(fā)酵提高57.73%。

2.6 發(fā)酵過程中酒醅氨態(tài)氮及酸性蛋白酶的變化

氨態(tài)氮是構(gòu)成微生物細胞蛋白質(zhì)和核酸的主要元素，氨態(tài)氮在蒸煮時便溶解于水，使可溶性氮增加，有利于微生物的作用，是發(fā)酵微生物生長繁殖的所需主要氮源。氨態(tài)氮的利用能保證各種酶在內(nèi)的蛋白質(zhì)合成，使細胞中已有的酶活化。

圖6 發(fā)酵酒醅氨態(tài)氮及酸性蛋白酶變化趨勢Fig.6 Changes of ammonium nitrogen content and acid protease activity

由圖6可知，在0～24h內(nèi)，酒醅中氨態(tài)氮含量及酸性蛋白酶活力同時呈顯著性增高(P＜0.0 5)；24 h后，蛋白酶活力逐漸降低，氨態(tài)氮被微生物利用，含量也降低。目前，關(guān)于發(fā)酵酒生產(chǎn)過程中氨態(tài)氮與酸性蛋白酶的變化之間的關(guān)系還未見其他報道。多菌種曲氨態(tài)氮與多菌種曲蛋白酶活力呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。傳統(tǒng)曲氨態(tài)氮與傳統(tǒng)曲蛋白酶活力呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)。

2.7 發(fā)酵過程中酒醅的α-淀粉酶活性的變化

圖7 發(fā)酵酒醅α-淀粉酶變化趨勢Fig.7 Change of α-amylases activity during fermentation

α-淀粉酶能在較高溫度下隨機水解淀粉、可溶性糊精及低聚糖中的α-1,4-葡萄糖苷鍵，酶作用后可使糊化淀粉的黏度迅速降低，變成液體淀粉，水解生成糊精和少量葡萄糖、麥芽糖。由圖7可知，發(fā)酵酒醅α-淀粉酶在24h內(nèi)顯著升高(P＜0.05)，然后又顯著下降(P＜0.05)。說明在24h時淀粉被水解速率最快，產(chǎn)生大量還原糖，為后期發(fā)酵提供充足的碳源。多菌種曲發(fā)酵過程中的α-淀粉酶最大值是傳統(tǒng)曲發(fā)酵α-淀粉酶最大值的3倍，α-淀粉酶活性高可以更快更有效的水解淀粉產(chǎn)生還原糖。

2.8 多菌種發(fā)酵曲青稞酒的游離氨基酸含量檢測結(jié)果

表2 多菌種發(fā)酵青稞酒的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition in highland barley wine fermented with multi-strain starter

由表2可知，多菌種發(fā)酵的青稞酒產(chǎn)品檢測出16種氨基酸，其總氨基酸含量80.923mg/100mL，略低于傳統(tǒng)優(yōu)良青稞酒氨基酸含量，并且缺乏蛋氨酸。

2.9 多菌種曲發(fā)酵青稞酒與傳統(tǒng)發(fā)酵青稞酒的感官評定

不管是傳統(tǒng)曲還是多菌種曲，隨著發(fā)酵的進行，青稞酒中的甜、酸、酒香等逐漸形成，風(fēng)味也逐漸變佳，多菌種曲發(fā)酵速度稍快，酒味更加濃郁，在60h已經(jīng)具有青稞酒的典型風(fēng)味。感官檢驗說明風(fēng)味較好的多菌種曲或者傳統(tǒng)青稞酒的發(fā)酵時間約為60～72h。以傳統(tǒng)曲釀造的優(yōu)良青稞酒為對照，對多菌種發(fā)酵青稞酒進行感官評價結(jié)果如表3所示，多菌種發(fā)酵的青稞酒的色澤淺灰色至淺黃色，色澤正，有光澤；香氣清爽、淡雅、醇香，沒有異雜味；口味清雅、爽口，甜味、酸味、澀味、苦味協(xié)調(diào)，口感醇和；整體表現(xiàn)為清雅、醇和，酒味較重，相互協(xié)調(diào)，具有青稞酒典型特征與風(fēng)格。

表3 多菌種發(fā)酵的青稞酒的感官評價Table 3 Sensory evaluation score of barley wine fermented with multi-strain starter

多菌種發(fā)酵青稞酒乙醛等醛類大幅度減少，高級醇含量也低于傳統(tǒng)曲青稞酒，說明多菌種發(fā)酵能降低這兩類物質(zhì)的含量，使青稞酒的安全性提高，具體表現(xiàn)為能減少傳統(tǒng)青稞酒飲后“上頭”的不適癥狀。多菌種發(fā)酵青稞酒在感官得分上接近傳統(tǒng)青稞酒，本實驗的多菌種曲發(fā)酵青稞酒，也經(jīng)藏民同胞品嘗，普遍表示能夠接受這種新工藝青稞酒。說明本實驗生產(chǎn)的青稞酒保持了傳統(tǒng)青稞酒的主體風(fēng)味。

3 結(jié) 論

青稞酒多菌種曲發(fā)酵過程中，表現(xiàn)出類似傳統(tǒng)發(fā)酵的物質(zhì)成分動態(tài)變化趨勢，多菌種曲發(fā)酵，pH值和總酸的相關(guān)性好，說明醪液中酸的種類少，易于工業(yè)生產(chǎn)，控制產(chǎn)品質(zhì)量，品溫緩升緩降，與傳統(tǒng)曲發(fā)酵相比變化趨勢更平緩，利于微生物生長。水分含量逐漸增高且大于傳統(tǒng)曲發(fā)酵，酒醅發(fā)酵更徹底。還原糖和糖化酶活力均高于傳統(tǒng)曲發(fā)酵，且在24h內(nèi)顯著增加，酒醅殘?zhí)歉?，發(fā)酵更徹底，提高了原料利用率?？偺呛途凭w積分數(shù)的相關(guān)性好，比傳統(tǒng)曲發(fā)酵更好的利用了還原糖進行酒精發(fā)酵，酒精體積分數(shù)提高了57.73%。酒醅中酸性蛋白酶活力及氨態(tài)氮含量同時呈顯著性增高。α-淀粉酶24h時活性最大，大量水解淀粉產(chǎn)生還原糖，是傳統(tǒng)曲α-淀粉酶的3倍?？偘被岷恐挥?0.923mg/100mL，缺乏蛋氨酸，低于傳統(tǒng)曲發(fā)酵的青稞酒。感官評定表明風(fēng)味較好的多菌種曲青稞酒的發(fā)酵時間約為60～72h，并保持了傳統(tǒng)青稞酒的主體風(fēng)味。

青稞酒發(fā)酵過程中化學(xué)成分的變化會對酒的風(fēng)味產(chǎn)生影響。國內(nèi)對傳統(tǒng)發(fā)酵酒黃酒風(fēng)味研究及國外對清酒的研究都較為成熟[18-23]，青稞酒的后續(xù)研究應(yīng)借鑒這些方法，研究青稞酒主體風(fēng)味成分的組成及形成機制，以期從根本上控制青稞酒的風(fēng)味。

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Changes in Chemical Components during Fermentation of Highland Barley Wine with Multi-Strain Starter

CAO Yan1，DU Mu-ying1,2,*，KAN Jian-quan1,2，CHEN Zong-dao1,2
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400715, China)

The changes in chemical components of highland barley wine during fermentation with multi-strain starter were studied and compared with those of traditional fermented highland barley wine. The results showed that the dynamic change patterns of chemical components during fermentation with multi-strain starter and traditional starter were similar. pH value decreased rapidly at first and then kept stable at pH 4.0-4.3, the measured total acidity showed an increasing trend. Fermentation temperature increased first and then dropped gradually with the highest value of about 36.2 ℃. Saccharifying enzyme activity and reducing sugar content increased significantly during 0-24 h, and then decreased till the end of fermentation. Total sugar content kept decreasing throughout the whole process. The alcohol concentration fermented by multi-strain starter was 10.30% which indicated a significant (P ＜ 0.05) increase by 57.73% compared with that obtained using traditional starter. Both ammonia-N content and acid proteinase activity increased in the early stages of fermentation followed by a slow decrease. Total free amino acid (FAA) in the final product fermented by multi-strain starter was 80.923 mg/100 mL and no methionine was detected in it. Sensory evaluation showed that the optimal fermentation duration was 60-72 h for highland barley wine production by multistrain starter. Under this condition, the product was acceptable and maintained the major flavor of wine fermented by traditional starter as evaluated by sensory evaluation.

highland barley wine；fermentation with multi-strain starter；chemical composition

TS261.7

A

1002-6630(2012)11-0252-05

2011-09-30

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目(XDJK2009C040) ；西南大學(xué)博士基金項目(SWUB2008068)

曹妍(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為食品加工與安全。E-mail：watchmatch@163.com

*通信作者：杜木英(1972—)，女，副教授，博士，研究方向為微生物與發(fā)酵工程。E-mail：muyingdu@swu.edu.cn