兔源益生菌Tu-115菌株鑒定及其產(chǎn)纖維素酶固體發(fā)酵條件優(yōu)化

尚 偉 姜軍坡 王世英 朱寶成

纖維素酶由起協(xié)同作用的葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶、β-葡聚糖苷酶等3個(gè)主要組分組成，它可將纖維素降解產(chǎn)生葡萄糖，并可進(jìn)一步發(fā)酵生產(chǎn)酒精、SCP飼料蛋白、有機(jī)酸等物質(zhì)，對(duì)緩解全球能源危機(jī)、飼料資源緊張、保護(hù)環(huán)境等具有很重要的意義[1-2]。細(xì)菌和真菌都可以產(chǎn)生纖維素酶；細(xì)菌主要產(chǎn)中性纖維素酶和堿性纖維素酶[3]，較真菌纖維素酶具有更好的耐堿、耐熱性，更適于工業(yè)生產(chǎn)，因此，細(xì)菌纖維素酶已成為研究的熱點(diǎn)[4]。

通常細(xì)菌纖維素酶的產(chǎn)量較少，篩選高產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌菌株并采用合理、有效的發(fā)酵方式使得纖維素酶各組分呈現(xiàn)較佳的協(xié)同作用，提高細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶量，對(duì)于細(xì)菌纖維素酶的應(yīng)用具有重要意義。葉明等[5]從土壤中篩選出產(chǎn)纖維素酶的蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）B1菌株，并通過(guò)經(jīng)微波-硫酸二乙酯復(fù)合誘變得到具有較高產(chǎn)纖維素酶活能力的正突變菌株B1-1，優(yōu)化發(fā)酵條件后纖維素酶活可以達(dá)到0.436 IU/ml。呂靜琳等[6]從腐爛朽木中篩選得到高產(chǎn)纖維素酶的Bacillus cereus LT3菌株，用20 g/l甘蔗渣，pH值7.0、30℃培養(yǎng)120 h，CMC酶酶活為71.17 U/ml，濾紙酶酶活為33.37 U/ml。侯進(jìn)慧等[7]從農(nóng)田、農(nóng)產(chǎn)品果實(shí)表面篩選出一株產(chǎn)低溫纖維素酶活力較高的Bacillus cereus T34菌株，優(yōu)化后纖維素酶酶活達(dá)到1.43 U/ml。Lee等[8]在7 L的生物反應(yīng)器中對(duì)從海洋中篩選的Bacillus subtilis subsp.subtilis A-53菌株產(chǎn)羧甲基纖維素酶的液體發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，在7 L和100 L的生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的纖維素酶的量分別可以達(dá)到150.3和196.8 U/ml。胡青平[9]對(duì)細(xì)菌菌株Z1產(chǎn)纖維素酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化，CMC酶活力最高可達(dá)1325 μg/(ml·min)，濾紙酶活力最高可達(dá)93.8 μg/(ml·min)。

Tu-115菌株是本研究組從兔子盲腸中篩選得到的一株既具有抑制大腸桿菌活性，又可在胞外大量產(chǎn)生纖維素酶的優(yōu)良菌株。本研究欲測(cè)定Tu-115菌株的生理生化特性，并對(duì)其進(jìn)行16S rDNA序列分析，以鑒定其種屬。分別以CMC和濾紙為底物測(cè)定纖維素酶比活力，采用單因素試驗(yàn)考察發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源、碳氮比例、麩皮粒度、溫度、發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)該菌株產(chǎn)纖維素酶的影響；以濾紙為底物測(cè)定纖維素酶比活力，采用正交試驗(yàn)考察培養(yǎng)基料水比、接種量、培養(yǎng)基初始pH值及裝瓶量等因素對(duì)Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響，以確定Tu-115菌株固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最適條件，為該菌株應(yīng)用于纖維素酶生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器

Tu-115菌株，由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

Mandel's無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液及DNS試劑配制方法參考文獻(xiàn)[10]。

芽孢桿菌種子培養(yǎng)基：蛋白胨2 g、蔗糖2 g、Mandel′s無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液 100 ml，自然 pH 值。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨 2 g、蔗糖 2 g、Mandel′s無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液8 ml，自然pH值。

ZHWY-2112B型雙層搖床，上海智誠(chéng)分析儀器有限公司生產(chǎn)；GL-21M型高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)；Labo Autoclave型高壓滅菌鍋，日本Sanyo公司生產(chǎn)；AIR TECH超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司生產(chǎn)；SPX-250型智能生化培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)；BS 214 D型分析天平，德國(guó)Sartorius公司生產(chǎn)；6405紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，英國(guó)Jenway公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 Tu-115菌株鑒定

1.2.1.1 菌株形態(tài)特征及生理生化特征的測(cè)定

菌株形態(tài)特征及生理生化特征測(cè)定依據(jù)東秀珠等《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[11]。

1.2.1.2 16S rDNA序列分析

采用通用引物27F/1492R進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成并進(jìn)行測(cè)序。將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行BLAST分析，并選取相似性較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株用MEGA 4.1以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.2 發(fā)酵條件對(duì)Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶影響的測(cè)定

挑取菌種，接種于種子培養(yǎng)基中，裝瓶量為100 ml/250 ml。于200 r/min，37℃，搖床培養(yǎng)12 h后使用。

基礎(chǔ)發(fā)酵條件為：在250 ml的三角瓶中放入4.0 g發(fā)酵底物（除另有說(shuō)明外，碳源2.0 g和氮源2.0 g），8 ml營(yíng)養(yǎng)液，Tu-115菌株種子液2 ml，30℃下培養(yǎng)48 h。

測(cè)發(fā)酵物的質(zhì)量，與發(fā)酵前加入的培養(yǎng)基質(zhì)量比較。向三角瓶中加入一定體積的蒸餾水，室溫下浸泡1 h，期間不斷攪拌。混勻后取1 ml加入EP管中，12000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)定酶活力。取樣后，測(cè)定三角瓶中殘余發(fā)酵液的體積。分別測(cè)定出每1 g發(fā)酵物中含有的纖維素酶活力和每瓶發(fā)酵物中含有纖維素酶的總活力。

以CMC為底物測(cè)定纖維素酶活力的方法[12]：每1min催化CMC水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為一個(gè)CMC酶活力單位（IU）。

以濾紙為底物測(cè)定纖維素酶活力的方法[13]：每1 min催化濾紙水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為一個(gè)濾紙酶活力單位(IU)。

每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3次平行，每個(gè)平行測(cè)定2次，最后取平均值。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定各因素的最適水平。每一個(gè)因素的優(yōu)化都在上一個(gè)因素最優(yōu)水平上進(jìn)行。

1.2.2.1 單因素試驗(yàn)分析

改變?cè)囼?yàn)條件，對(duì)產(chǎn)纖維素酶活力進(jìn)行單因素分析：①分別以葡萄糖：麩皮(1：1)、麥芽糖：麩皮(1：1)、蔗糖：麩皮(1：1)、糖蜜：麩皮(1：1)、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、糖蜜、麩皮作為碳源，考察發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的影響；②取最優(yōu)碳源，按碳源：營(yíng)養(yǎng)液=1：2加入Mandel's營(yíng)養(yǎng)液，分別以尿素、NH4Cl、(NH4)2SO4、KNO3、NaNO3、NH4NO3、蛋白胨、酵母膏和豆餅粉作為氮源，稱(chēng)取0.3 g，考察發(fā)酵培養(yǎng)基氮源的影響；③取最優(yōu)碳源，按碳源：營(yíng)養(yǎng)液=1：2加入Mandel′s營(yíng)養(yǎng)液，再分別稱(chēng)取最優(yōu)氮源 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 g，考察發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮比例的影響；④取最優(yōu)碳源、氮源及碳氮比例，將麩皮粉碎，依次過(guò)20目、40目、60目和100目篩，按麩皮粒度從大到小的次序依次編號(hào)為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)麩皮粉末，分別取相應(yīng)的麩皮粉末作為碳源，配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，考察發(fā)酵培養(yǎng)基麩皮粒度的影響；⑤取最優(yōu)碳源、氮源及碳氮比例，麩皮取最適宜粒度，接種后分別在28、30、32、35、37、40 ℃環(huán)境中培養(yǎng)，考察發(fā)酵溫度的影響；⑥取最優(yōu)碳源、氮源及碳氮比例，麩皮取最適宜粒度，在最適溫度下發(fā)酵，從發(fā)酵24 h開(kāi)始，每隔24 h抽樣進(jìn)行酶活測(cè)定，直至240 h，考察發(fā)酵時(shí)間的影響。

1.2.2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件

選取培養(yǎng)基料水比、接種量、培養(yǎng)基初始pH值、裝瓶量4個(gè)因素，設(shè)計(jì)4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件優(yōu)化。培養(yǎng)后，以濾紙為底物測(cè)定纖維素酶比活力，并進(jìn)行比較。各試驗(yàn)組數(shù)據(jù)均為3次平行試驗(yàn)的平均值。

采用SPSS軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差（Range）分析和一般線性模型（General Linear Model，GLM）分析，以得出最佳培養(yǎng)基組成。若優(yōu)化的最佳發(fā)酵條件未在正交表中出現(xiàn)，則平行測(cè)定最佳發(fā)酵條件和正交表中最佳條件下對(duì)應(yīng)的纖維素酶比活力，重復(fù)6次，進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tu-115菌株鑒定結(jié)果

2.1.1 菌株形態(tài)特征及生理生化特征測(cè)定結(jié)果

Tu-115菌株生理生化特征測(cè)定結(jié)果（見(jiàn)表1）表明，該菌株呈現(xiàn)典型的芽孢桿菌屬生理生化特征。Tu-115菌株為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，菌體兩端平整，芽孢中生，見(jiàn)圖1（a）。在NB培養(yǎng)基上菌落為圓形，乳白色，表面光滑，有火山狀凸起，邊緣鋸齒狀，見(jiàn)圖1（b）。綜合以上結(jié)果可以初步將Tu-115菌株鑒定為芽孢桿菌。

表1 Tu-115菌株生理生化試驗(yàn)的結(jié)果

圖1 Tu-115菌株革蘭氏染色結(jié)果及其菌落形態(tài)

2.1.2 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析

基于與Tu-115菌株同源性高的菌株和芽孢桿菌屬其他種的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，圖2所示，其中與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）同源性最高。Tu-115菌株與解淀粉芽孢桿菌的相似性高達(dá)99.16%（見(jiàn)表2）。結(jié)合其生理生化特征，可確定Tu-115菌株為解淀粉芽孢桿菌。

圖2 芽孢桿菌Tu-115菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

表2 Tu-115菌株與幾種標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似性比較

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 單因素試驗(yàn)分析各因素對(duì)Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

由圖3（a）可知，在各個(gè)碳源組合中，麩皮對(duì)應(yīng)的兩種纖維素酶比活力均較高，同時(shí)發(fā)酵物具有較高的纖維素酶總活力。由圖3（b）可知，同一氮源下分別采用CMC和濾紙為底物測(cè)定纖維素酶比活力，其結(jié)果相差較大，以兩種纖維素酶比活力同時(shí)較高者作為氮源較為適宜，故選取豆餅粉為最適宜氮源，此時(shí)發(fā)酵物呈現(xiàn)中等的纖維素酶總活力。由圖3（c）可知，當(dāng)碳氮比為4：1時(shí)對(duì)應(yīng)的兩種纖維素酶比活力均較高，此時(shí)發(fā)酵物呈現(xiàn)較高的纖維素酶總活力。

圖3 碳源、氮源及碳氮比對(duì)Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

由圖4（a）可知，當(dāng)以1號(hào)麩皮粉末為碳源時(shí)，對(duì)應(yīng)的兩種纖維素酶比活力均較高，并表現(xiàn)出較高的纖維素酶總活力；由圖4（b）可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為35℃時(shí)，對(duì)應(yīng)的兩種纖維素酶比活力均最高，同時(shí)具有較高的纖維素酶總活力；由圖4（c）可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為144 h時(shí)，對(duì)應(yīng)的兩種纖維素酶比活力均最高，并具有較高的纖維素酶總活力。

綜上所述，Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的適宜條件為：以麩皮為碳源，豆餅粉為氮源，碳氮比為4：1，麩皮粒度在20目以上，在35℃靜置培養(yǎng)144 h。在此基礎(chǔ)上用正交試驗(yàn)優(yōu)化Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶固體發(fā)酵條件。

圖4 麩皮粒度、培養(yǎng)溫度及發(fā)酵時(shí)間對(duì)Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

2.2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化Tu-115菌株胞外產(chǎn)纖維素酶固體發(fā)酵條件

改變培養(yǎng)基料水比、培養(yǎng)基初始pH值、接種量、裝瓶量，進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行極差分析和GLM分析，分析結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

由表3可知，各因素水平影響的強(qiáng)弱順序?yàn)锳2＞A3＞A1，B2＞B1＞B3，C2＞C3＞C1，D2＞D3＞D1；各因素的主次順序?yàn)镈＞B＞C＞A，即裝瓶量＞培養(yǎng)基初始pH值＞接種量＞培養(yǎng)基料水比。由表4可知，因素D和B，即裝瓶量和培養(yǎng)基初始pH值對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，而因素A和C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著，各因素的主次順序?yàn)镈＞B＞C＞A。綜上所述，A2B2C2D2為產(chǎn)纖維素酶的最佳發(fā)酵條件，與A1B2C2D2進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)(見(jiàn)表5)，結(jié)果表明，以濾紙為底物時(shí)，A2B2C2D2對(duì)應(yīng)的平均纖維素酶比活力為64.06 IU/g(n=6)，以CMC為底物時(shí)，A2B2C2D2對(duì)應(yīng)的平均纖維素酶比活力為73.35 IU/g（n=6）；以濾紙為底物時(shí)，A1B2C2D2對(duì)應(yīng)的平均纖維素酶比活力為60.95 IU/g（n=6），以 CMC 為底物時(shí)，A1B2C2D2對(duì)應(yīng)的平均纖維素酶比活力為72.65 IU/g（n=6）。綜上所述，正交試驗(yàn)優(yōu)化出的發(fā)酵條件對(duì)應(yīng)著較高的纖維素酶比活力，即最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)基料水比為1：1、培養(yǎng)基初始pH值4.0、接種量20%、裝瓶量4 g/250 ml。

表3 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

表4 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果的一般線性模型分析

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

經(jīng)鑒定，可在胞外產(chǎn)纖維素酶的Tu-115菌株為解淀粉芽孢桿菌。以麩皮為碳源，豆餅粉為氮源，碳氮比4： 1，料水比1： 1，接種量20%，初始pH值4.0，麩皮粒度大于20目，裝瓶量4 g/250 ml，在35℃靜置培養(yǎng)144 h時(shí)，可以達(dá)到較高的纖維素酶比活力。

3.2 討論

Tu-115菌株具有胞外產(chǎn)纖維素酶的特性，具有這種特性的細(xì)菌可以通過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化，增加其胞外分泌的纖維素酶量，增大其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的可行性。纖維素酶是一種多組分的酶系，各組分間又存在著協(xié)同作用。根據(jù)纖維素酶水解的協(xié)調(diào)理論，水解過(guò)程首先由內(nèi)切葡聚糖酶作用于纖維素酶分子的非結(jié)晶區(qū)內(nèi)部的β-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)生的β-寡聚糖再被外切葡聚糖酶作用生成纖維二糖[14]，所以內(nèi)切葡聚糖酶活力的大小很重要。以CMC為底物測(cè)定的纖維素酶活力表征的是內(nèi)切葡聚糖酶活力；濾紙結(jié)構(gòu)中包括結(jié)晶型纖維素和非結(jié)晶型纖維素，所以通常用以濾紙為底物測(cè)定的纖維素酶活力表征纖維素酶復(fù)合體系的總活力[15]；單因素優(yōu)化中，同時(shí)采用分別以CMC、濾紙為底物測(cè)定的兩種纖維素酶比活力為指標(biāo)，可以較好地評(píng)價(jià)纖維素酶的活力；正交試驗(yàn)中，采用以濾紙為底物測(cè)定的纖維素酶比活力為指標(biāo)，可以更真實(shí)地表征優(yōu)化條件下產(chǎn)纖維素酶復(fù)合體系的活力。

表5 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證

解淀粉芽孢桿菌具有廣泛的抑制真菌和細(xì)菌的活性[16]，這和本研究組前期的結(jié)果相一致，Tu-115菌株具有抑制大腸桿菌等病原菌的活性。Lee等[17]從土壤中篩選出1株胞外產(chǎn)纖維素酶的解淀粉芽孢桿菌DL-3菌株，并對(duì)其胞外產(chǎn)生的纖維素酶進(jìn)行了純化和表征。國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)該種屬細(xì)菌胞外產(chǎn)纖維素酶的報(bào)道。本研究采用固體發(fā)酵的方式，利用廉價(jià)的麩皮，在最優(yōu)發(fā)酵條件下以CMC、濾紙為底物測(cè)定的兩種纖維素酶比活力分別可達(dá)73.35 IU/g和64.06 IU/g，CMC酶和濾紙酶活力基本相當(dāng)，說(shuō)明Tu-115菌株產(chǎn)的纖維素酶中內(nèi)切葡聚糖酶和其他幾種纖維素酶組分的比例較為適宜，表現(xiàn)出較佳的協(xié)同作用，具有很高的應(yīng)用潛力。

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