枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

黃璠 蔡俊

在我國，飼用酶制劑的開發(fā)與利用始于20世紀(jì)90年代[1]。多年來，人們發(fā)現(xiàn)蛋白酶對動(dòng)物尤其是幼齡動(dòng)物有著獨(dú)特的作用，目前飼料工業(yè)中應(yīng)用的蛋白酶多為酸性蛋白酶，而不同pH值的蛋白酶對飼料作用的影響正成為飼料行業(yè)的一個(gè)研究熱點(diǎn)，已有相關(guān)報(bào)道，中性蛋白酶作為飼料添加劑有很好的效果[2－4]。但中性蛋白酶的產(chǎn)量低、成本高等因素限制了其大規(guī)模應(yīng)用[5]。本研究以枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的發(fā)酵條件為研究對象，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了產(chǎn)酶的發(fā)酵條件，取得了很好的效果，為進(jìn)一步提高該菌產(chǎn)中性蛋白酶的能力奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/l、牛肉膏 5 g/l、氯化鈉5 g/l、瓊脂 20 g/l、水 1 L，pH 值 7.2～7.4。

種子培養(yǎng)基：液體斜面培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/l、牛肉膏5 g/l、蔗糖10 g/l、磷酸氫二鈉 4 g/l、硫酸鎂 0.2 g/l、水 1 L，pH 值 7.2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 初始發(fā)酵條件

取活化好的斜面菌株，接種一環(huán)到一級種子培養(yǎng)基（50/250 ml），37℃、160 r/min培養(yǎng)14 h后，以3%(V/V)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基（50/250 ml），37℃、160 r/min培養(yǎng)48 h。

1.2.2 蛋白酶活力測定[6]

按國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T23527—2009)，采用 Folin－酚法測定中性蛋白酶活力。

1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.3.1 發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)，分別考察裝液量、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵周期、接種量和發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響。裝液量(250 ml三角瓶中)分別為 30、50、70、90 ml；轉(zhuǎn)速分別取160、180、200和220 r/min；培養(yǎng)基初始pH值分別取 6.2、6.7、7.2、7.7和 8.2；發(fā)酵周期分別取24、36、48、60、72 和 84 h；接種量分別取 1%、2%、3%、4%、5%；發(fā)酵溫度分別取33、35、37、39和 41 ℃。

1.2.3.2 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取部分影響較大的因素（裝液量、初始pH值、發(fā)酵周期），進(jìn)一步縮小范圍進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因子與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因子與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同單因素對發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶的影響(見圖1～圖6)

圖1 裝液量對產(chǎn)酶的影響

由圖1可知，最優(yōu)裝液量為50 ml。此時(shí)(即初始條件下)酶活為36.755 ml，由于裝液量小，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分少，不利于產(chǎn)酶，且資源利用率低。裝液量大，可能對溶氧有一定的影響，枯草芽孢桿菌是好氧菌，也不利于產(chǎn)酶。

圖2 轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響

由圖2可知，轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)酶活最大，此時(shí)酶活為46.988 U/ml，隨著轉(zhuǎn)速的增大，酶活增大，說明轉(zhuǎn)速增大，溶氧增大，有利于產(chǎn)酶；當(dāng)轉(zhuǎn)速大于200 r/min時(shí)酶活降低，可能是轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大，對枯草芽孢桿菌本身有損害，從而使酶活降低。

由圖3可知，最優(yōu)初始pH值為6.7，此時(shí)酶活為78.411 U/ml，pH值繼續(xù)升高，酶活降低，說明弱酸性培養(yǎng)基有利于菌株產(chǎn)酶；由圖4可知，最優(yōu)發(fā)酵周期為60 h，此時(shí)酶活為86.987 U/ml；由圖5可知，最優(yōu)接種量為4%，此時(shí)酶活為109.041 U/ml；由圖 6可知，最優(yōu)發(fā)酵溫度為37℃，此時(shí)酶活為120.067 U/ml，溫度過低不利于菌體的生長和代謝產(chǎn)酶，溫度過高菌體易衰老而影響其正常的生長和代謝。

圖3 初始pH值對產(chǎn)酶的影響

圖4 發(fā)酵周期對產(chǎn)酶的影響

圖5 接種量對產(chǎn)酶的影響

圖6 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響

2.2 部分發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)研究

由上述單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，裝液量、初始pH值和發(fā)酵周期對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響較大，進(jìn)一步縮小范圍，采用L9（33）正交設(shè)計(jì)法進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果和方差分析結(jié)果分別見表 2、表 3。

表2 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由表2可知，這3種因素對產(chǎn)酶的影響效果不同，其影響程度為：裝液量(ml)＞初始pH值＞發(fā)酵周期(h)，這3種因素對產(chǎn)酶影響都是顯著的，所得的最優(yōu)組合為 A3B3C2，即裝液量 60 ml，初始pH值6.9，發(fā)酵周期60 h，恰好與正交表中的方案9一致，在此發(fā)酵條件下對產(chǎn)酶最有利，最大酶活為151.319 U/ml。

3 結(jié)論

通過發(fā)酵條件（裝液量、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵周期、接種量和發(fā)酵溫度）的單因素試驗(yàn)以及裝液量、培養(yǎng)基初始pH值和發(fā)酵周期的正交試驗(yàn)，得到了最優(yōu)發(fā)酵條件為裝液量 60 ml，轉(zhuǎn)速200 r/min，初始pH值6.9，發(fā)酵周期 60 h，接種量4%，發(fā)酵溫度37℃。由正交試驗(yàn)證明了裝液量、培養(yǎng)基初始pH值和發(fā)酵周期對產(chǎn)酶影響顯著。通過發(fā)酵條件的優(yōu)化，酶活提高了311.7%。

[1]Bedford MR.Exogenous enzymes in monogastric nutrition－their current value and future benefits[J].Animal Feed Science and Technology,2000,86:1－13.

[2]凌寶明,馮定遠(yuǎn),左建軍.飼用蛋白酶的研究進(jìn)展[J].飼料工業(yè),2009,30(22):7－10.

[3]陳建明,葉金云,許堯興,等.飼料中添加中性蛋白酶對青魚生長、消化及魚體組成的影響[J].水生生物學(xué)報(bào),2009,33(4):726－731.

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[5]孫曉鳴,王萍,鄔向東.產(chǎn)中性蛋白酶芽孢桿菌配伍發(fā)酵響應(yīng)面法研究[J].中國食品學(xué)報(bào),2010,10(2):117－124.

[6]中華人民共和國國家技術(shù)監(jiān)管局.GB/T23527－2009ICS67.220.22X69－2009,蛋白酶制劑[S].北京:標(biāo)準(zhǔn)出版社,2009.