黃璠 蔡俊
在我國,飼用酶制劑的開發(fā)與利用始于20世紀(jì)90年代[1]。多年來,人們發(fā)現(xiàn)蛋白酶對動(dòng)物尤其是幼齡動(dòng)物有著獨(dú)特的作用,目前飼料工業(yè)中應(yīng)用的蛋白酶多為酸性蛋白酶,而不同pH值的蛋白酶對飼料作用的影響正成為飼料行業(yè)的一個(gè)研究熱點(diǎn),已有相關(guān)報(bào)道,中性蛋白酶作為飼料添加劑有很好的效果[2-4]。但中性蛋白酶的產(chǎn)量低、成本高等因素限制了其大規(guī)模應(yīng)用[5]。本研究以枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的發(fā)酵條件為研究對象,通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了產(chǎn)酶的發(fā)酵條件,取得了很好的效果,為進(jìn)一步提高該菌產(chǎn)中性蛋白酶的能力奠定了基礎(chǔ)。
1.1.1 菌種
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),本實(shí)驗(yàn)室保藏。
1.1.2 培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基:蛋白胨 10 g/l、牛肉膏 5 g/l、氯化鈉5 g/l、瓊脂 20 g/l、水 1 L,pH 值 7.2~7.4。
種子培養(yǎng)基:液體斜面培養(yǎng)基。
發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/l、牛肉膏5 g/l、蔗糖10 g/l、磷酸氫二鈉 4 g/l、硫酸鎂 0.2 g/l、水 1 L,pH 值 7.2。
1.2.1 初始發(fā)酵條件
取活化好的斜面菌株,接種一環(huán)到一級種子培養(yǎng)基(50/250 ml),37℃、160 r/min培養(yǎng)14 h后,以3%(V/V)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(50/250 ml),37℃、160 r/min培養(yǎng)48 h。
1.2.2 蛋白酶活力測定[6]
按國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T23527—2009),采用 Folin-酚法測定中性蛋白酶活力。
1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化
1.2.3.1 發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)
采用單因素試驗(yàn),分別考察裝液量、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵周期、接種量和發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響。裝液量(250 ml三角瓶中)分別為 30、50、70、90 ml;轉(zhuǎn)速分別取160、180、200和220 r/min;培養(yǎng)基初始pH值分別取 6.2、6.7、7.2、7.7和 8.2;發(fā)酵周期分別取24、36、48、60、72 和 84 h;接種量分別取 1%、2%、3%、4%、5%;發(fā)酵溫度分別取33、35、37、39和 41 ℃。
1.2.3.2 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)
在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取部分影響較大的因素(裝液量、初始pH值、發(fā)酵周期),進(jìn)一步縮小范圍進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn),正交試驗(yàn)因子與水平設(shè)計(jì)見表1。
表1 正交試驗(yàn)因子與水平設(shè)計(jì)
圖1 裝液量對產(chǎn)酶的影響
由圖1可知,最優(yōu)裝液量為50 ml。此時(shí)(即初始條件下)酶活為36.755 ml,由于裝液量小,培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分少,不利于產(chǎn)酶,且資源利用率低。裝液量大,可能對溶氧有一定的影響,枯草芽孢桿菌是好氧菌,也不利于產(chǎn)酶。
圖2 轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響
由圖2可知,轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)酶活最大,此時(shí)酶活為46.988 U/ml,隨著轉(zhuǎn)速的增大,酶活增大,說明轉(zhuǎn)速增大,溶氧增大,有利于產(chǎn)酶;當(dāng)轉(zhuǎn)速大于200 r/min時(shí)酶活降低,可能是轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大,對枯草芽孢桿菌本身有損害,從而使酶活降低。
由圖3可知,最優(yōu)初始pH值為6.7,此時(shí)酶活為78.411 U/ml,pH值繼續(xù)升高,酶活降低,說明弱酸性培養(yǎng)基有利于菌株產(chǎn)酶;由圖4可知,最優(yōu)發(fā)酵周期為60 h,此時(shí)酶活為86.987 U/ml;由圖5可知,最優(yōu)接種量為4%,此時(shí)酶活為109.041 U/ml;由圖 6可知,最優(yōu)發(fā)酵溫度為37℃,此時(shí)酶活為120.067 U/ml,溫度過低不利于菌體的生長和代謝產(chǎn)酶,溫度過高菌體易衰老而影響其正常的生長和代謝。
圖3 初始pH值對產(chǎn)酶的影響
圖4 發(fā)酵周期對產(chǎn)酶的影響
圖5 接種量對產(chǎn)酶的影響
圖6 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響
由上述單因素試驗(yàn)結(jié)果可知,裝液量、初始pH值和發(fā)酵周期對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響較大,進(jìn)一步縮小范圍,采用L9(33)正交設(shè)計(jì)法進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn),正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果和方差分析結(jié)果分別見表 2、表 3。
表2 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果
表3 方差分析結(jié)果
由表2可知,這3種因素對產(chǎn)酶的影響效果不同,其影響程度為:裝液量(ml)>初始pH值>發(fā)酵周期(h),這3種因素對產(chǎn)酶影響都是顯著的,所得的最優(yōu)組合為 A3B3C2,即裝液量 60 ml,初始pH值6.9,發(fā)酵周期60 h,恰好與正交表中的方案9一致,在此發(fā)酵條件下對產(chǎn)酶最有利,最大酶活為151.319 U/ml。
通過發(fā)酵條件(裝液量、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵周期、接種量和發(fā)酵溫度)的單因素試驗(yàn)以及裝液量、培養(yǎng)基初始pH值和發(fā)酵周期的正交試驗(yàn),得到了最優(yōu)發(fā)酵條件為裝液量 60 ml,轉(zhuǎn)速200 r/min,初始pH值6.9,發(fā)酵周期 60 h,接種量4%,發(fā)酵溫度37℃。由正交試驗(yàn)證明了裝液量、培養(yǎng)基初始pH值和發(fā)酵周期對產(chǎn)酶影響顯著。通過發(fā)酵條件的優(yōu)化,酶活提高了311.7%。
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