付佩彩 喻志源 劉 淼 唐榮華 王 偉 駱 翔

小膠質細胞約占成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞總量的10%－20%［1］。它是CNS原位免疫細胞，屬于單核細胞系，介導中樞神經(jīng)系統(tǒng)對感染、損傷等疾病的先天性免疫反應［2］。在CNS受損后小膠質細胞迅速激活，遷移至受損部位，并發(fā)生一系列特征性反應，如細胞增殖、形態(tài)改變、炎性因子分泌等［3］。LPA為類生長因子的脂類信號分子，與CNS損傷密切相關，它即是反應CNS受損程度的預警因子，也可作為致病因子促進CNS進一步損傷［4，5］。本研究采用LPA對小膠質細胞系BV2細胞進行干預，檢測BV2細胞活化分泌IL－1β和TNF－α的濃度變化，以探討LPA在CNS損傷中對小膠質細胞活化以及炎性因子分泌中的作用。

1 方法與材料

1.1 材料與試劑

BV2細胞系來自華中科技大同濟醫(yī)學院。DMEM／高糖培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Hyclone公司；胰蛋白酶購自美國GIBCO公司；多聚賴氨酸、LPA（溶血磷脂酸）和DAPI均購自美國sigma公司；LDH試劑盒購自南京建成生物研究所；ELISA試劑盒購自深圳達科為生物技術有限公司；小鼠抗Iba1購自美國Wako公司；CY3標記羊抗兔IgG購自美國Jackson公司。

1.2 BV2細胞復蘇及傳代培養(yǎng)

液氮凍存的BV2細胞，37°C迅速復蘇后用含10%胎牛血清的DMEM／高糖培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，當細胞達到90%融合時用0.25%胰酶消化細胞，進行傳代。

1.3 實驗分組

調整BV2細胞懸液中細胞密度為1×106／ml，接種于多聚懶氨酸（0.1 mg／ml）包被過的6孔板中，于37°C 5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，24 h應用于實驗。其中對照組在實驗開始時換用新鮮培養(yǎng)基，LPA組換用含10μM LPA的新鮮培養(yǎng)基。

1.4 LDH法檢測細胞培養(yǎng)基中LDH濃度

LDH法檢測10μM LPA作用于BV2細胞后培養(yǎng)基內LDH含量，以檢測LPA對BV2細胞毒性作用。嚴格按照試劑盒說明書要求操作，反應結束室溫5 min后用450 nm波長測定各孔吸光度。繪制標準曲線，依據(jù)標準曲線計算各孔相應的LDH濃度。

1.5 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)基中IL－1β和TNF－α濃度

ELISA法測定IL－1β和TNF－α濃度，操作嚴格按照試劑盒說明書要求進行。終止反應10分鐘內用檢測波長450 nm，參考610 nm波長測定各孔吸光度。繪制標準曲線，依據(jù)標準曲線計算各孔相應的IL－1β和 TNF－α濃度。

1.6 統(tǒng)計學處理

所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，應用SPSS軟件，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。用sigma plot作圖軟件作圖。

2 結 果

2.1 BV2細胞Iba1免疫熒光染色鑒定

傳代培養(yǎng)的BV2在培養(yǎng)24 h后貼壁細胞呈梭形，至第2～3 d BV2細胞生長呈90%融合，突起明顯增多延長。將BV2細胞做Iba1免疫熒光染色，證明傳代培養(yǎng)的BV2細胞表達小膠質細胞特異性抗原Iba1（圖1）。

2.2 BV2細胞分泌LDH的濃度變化

對照組和LPA組在各時間點（30min、1、3和6 h）的LDH分泌均無明顯差異（圖2）。

2.3 BV2細胞分泌IL－1β和TNF－α的濃度變化

LPA干預BV2細胞后1 hIL－1β和TNF－α較對照組顯著增加（P＜0.01）。IL－1β分泌在3 h達到峰值，而TNF－α分泌在6 h內持續(xù)增高。與對照組比較，IL－1β和TNF－α均在3 h增加最顯著（P＜0.01）（圖3、4）。

圖1 BV2細胞的小膠質細胞特性鑒定 培養(yǎng)的BV2細胞100%表達小膠質細胞特異性抗原Iba1；紅色為Iba1染色陽性，藍色為細胞核DAPI染色

圖2 各組分泌LDH濃度

圖3 各組BV2細胞培養(yǎng)液中TNF－α的濃度（與同時間點對照組比較，＊P＜0.01）

圖4 各組BV2細胞培養(yǎng)液中IL－1β的濃度（與同時間點對照組比較，＊P＜0.01）

3 討 論

小膠質細胞為CNS定居的免疫細胞，是CNS損傷后最早發(fā)生反應的細胞類型［6］?；罨男∧z質細胞可通過吞噬死亡細胞碎片、限制炎癥病灶擴大［7］、形成胞突包繞神經(jīng)軸突末梢、分泌小膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等作用對CNS損傷起到保護作用。但過度活化的小膠質細胞亦可導致神經(jīng)損傷，CNS缺血區(qū)域的神經(jīng)細胞可通過 ATP、CCL2／CCR2趨化因子受體途徑以及組織蛋白酶S／CX3CL1途徑激活小膠質細胞，誘導小膠質細胞產(chǎn)生炎性反應，分泌各種炎癥因子（TNF－α，IL－6，IL－1β）進而加重受損神經(jīng)元的損傷［8～10］。雖然關于小膠質細胞炎性因子釋放的研究眾多，但其炎性釋放機制仍未明確。

LPA是血清中的正常組分之一，血小板、炎癥細胞、神經(jīng)細胞、損傷細胞和內皮細胞受到各種刺激后均可生成，通過內分泌和旁／自分泌的方式釋放。在CNS受損后LPA的分泌增加并可促進CNS系統(tǒng)進一步損傷，但其機制未明確［4，5］。本研究結果發(fā)現(xiàn)LPA可顯著促進小膠質細胞系BV2細胞的活化，并促進其分泌IL－1β和TNF－α（P＜0.01），在3 h其促進作用最為顯著。已知的LPA可通過G12／13蛋白激活Rho／ROCK信號通路［11］，LPA可通過激活Rho后發(fā)揮細胞骨架重建、肌動蛋白應力纖維重建、細胞分化等作用。并有研究顯示抑制Rho／ROCK通路、可明顯抑制小膠質細胞炎性因子（TNF－α、IL－6、IL－1β）釋放［12］。因此，本研究推測LPA促進小膠質細胞炎性分泌可能為激活Rho／ROCK通路所致。

綜上所述，本研究結果提示LPA在小膠質細胞活化及其炎性分泌中發(fā)揮了重要作用；LPA促進小膠質細胞炎性因子分泌可能為其促進CNS損傷的原因之一，也為進一步了解CNS損傷后LPA的作用、小膠質細胞的活化機制及其調控方法提供了實驗依據(jù)。

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