張 鑫 董亞楠 楊石強 黃 鸝 付銀鋒 張春瑞 (河南科技大學醫(yī)學院解剖學教研室，洛陽 471003)

目前研究發(fā)現，肥大細胞是一種功能復雜、多樣的異質性細胞，其在機體中分布廣泛，尤其集中于血管附近，在皮膚與黏膜等與外界相鄰的組織中數量較多。肥大細胞顆粒中含有較多的組胺，是體內組胺的主要來源。近年來研究發(fā)現，肥大細胞除參與機體的過敏反應外，尚與防御、修復、抗腫瘤及組織修復與重建有關。血管活性腸多肽(Vasoactive intestinal peptide，VIP)及降鈣素基因相關肽(Calcitonin gene related peptide，CGRP)是神經末梢中廣泛分布的神經多肽，有報道指出，在這些神經末梢的周圍存在有豐富的肥大細胞，因此認為這種分布與神經-免疫對話(Nerve-immune cross-talking)機制有關［1，2］。VIP 及 CGRP 對肥大細胞功能影響的報道不多，且有相互矛盾之處［3，4］。本文應用 VIP、CGRP分別作用于分離的大鼠腹腔肥大細胞(Rat peritonealmast cells，RPMCs)以檢測他們對大鼠肥大細胞脫顆粒及細胞內［Ca2+］離子濃度的影響;同時應用VIP受體結合抑制劑(L-8-K)預處理RPMCs，以觀察神經多肽對大鼠肥大細胞功能的調節(jié)作用及其作用機制，了解這些神經多肽與肥大細胞的相互關系。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 成年雄性SD大鼠購于韓國大田試驗動物中心，體重250～300 g。大鼠被置于層流動物飼養(yǎng)柜中，室溫(23±2)℃，濕度(55±5)%，光照時間為7．00點～19．00點。飼以顆粒鼠飼料，自由飲水。

1．2 試劑 VIP、CGRP、L-8-K購自 Bachem 公司;48/80復合物、HEPES、牛血清白蛋白購自美國Sigma公司;Percoll細胞分離液購自瑞典Pharmacia公司;同位素組胺檢測試劑盒、45Ca檢測試劑盒購自美國PerkinElmer公司。

1．3 大鼠腹腔肥大細胞懸液的制備 用乙醚吸入麻醉SD大鼠，腹腔內注射 HEPES-Tyrode緩沖液(136 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，2 mmol/L CaCl2，11 mmol/L NaHCO3，0．6 mmol/L NaH2PO4，2.75 mmol/L MgCl2，5．4 mmol/L HEPES，1．0 g/L 牛血清白蛋白，1．0 g/L 葡萄糖，0．1 g/L 肝素，pH7．4)10 ml，輕輕按摩腹部90秒，打開腹腔，用巴氏吸管收集腹腔內液體，以Percoll密度梯度法純化肥大細胞。臺盼藍排除試驗顯示98%是活細胞;甲苯胺藍染色檢測顯示95%的細胞是肥大細胞。純化后，用HEPES-Tyrode緩沖液將其重新混懸成1×106肥大細胞/ml，置冰上備用。

1．4 組胺檢測 按照Choi等［5］描述的免疫酶法測定肥大細胞組胺釋放率。每Eppendorf管加入肥大細胞懸液200μl，37℃ 水浴預孵5分鐘，分別加入VIP、CGRE 使成不同的終濃度，5×10－7mg/L 48/80復合物作為陽性對照，0濃度陰性對照不加作用物而加入等量HEPES-Tyrode緩沖液;繼續(xù)孵育20分鐘后，置冰上終止反應;4℃ 3 000 r/min離心10分鐘分離細胞，獲取上清液。沉淀細胞用煮沸法破碎，離心，取上清液;同位素放射酶法、液態(tài)閃爍計數儀(Tri-carb 2900TR，美國Packard Bioscience公司)分別檢測兩種上清液中組胺的含量。組胺釋放百分率=上清液中組胺的釋放量/總組胺量(上清液中組胺釋放量+細胞中殘留組胺的量)×100%。

1．545Ca攝入量測定 以1×106細胞/ml的濃度將肥大細胞重新混懸于含 1．5μCi/ml45Ca的HEPES-Tyrode緩沖液中，4℃孵育10分鐘后，分裝，每Eppendorf管200μl;37℃預孵育10分鐘，分別加入VIP、CGRE使成不同的終濃度，5×10－7mg/L 48/80復合物作為陽性對照;37℃繼續(xù)孵育10分鐘后，加入4℃預冷的1 mmol/L LaCl3，終止反應;4℃3 000 r/min離心10分鐘，洗滌細胞3次;洗滌后的細胞加入10%Triton X-100劇烈震蕩破碎細胞，用液態(tài)閃爍計數儀分別檢測各組細胞的45Ca攝入量。

1．6 L-8-K對VIP誘導RPMC功能的抑制作用在RPMC中加入VIP之前，首先加入終濃度為5×10－6mol/L的L-8-K 25μl，37℃ 水浴預孵育5分鐘后，加入VIP使成不同的終濃度，繼續(xù)孵育20分鐘，置冰上終止反應;其余步驟同上，進一步檢測肥大細胞釋放組胺和45Ca攝入量。

2 結果

2．1 VIP、CGRP對大鼠肥大細胞脫顆粒及組胺釋放的影響 在倒置顯微鏡下觀察，懸浮于HEPESTyrode緩沖液中的大鼠腹腔肥大細胞直徑約15 μm，圓形或卵圓形，胞質內有豐富的細小顆粒，胞核明顯。5×10－7mg/L VIP和所有濃度的CGRP均不能引起大鼠肥大細胞明顯的形態(tài)變化;但5×10－7mol/L 48/80復合物、5×10－6mol/L 和 5×10－5mol/L的VIP均可引起肥大細胞脫顆粒變化，表現為細胞腫脹、顆粒融合、凸出、胞內出現空泡、顆粒釋放至細胞周圍等變化。

圖1 VIP和CGRP對大鼠腹腔肥大細胞組胺釋放的影響Fig．1 Effects of VIP and CGRP on histam ine release of RPMCs

同位素放射酶法檢測大鼠腹腔肥大細胞釋放組胺結果見圖1。5×10－7mg/L 48/80復合物可引起大鼠腹腔肥大細胞明顯釋放組胺(與0濃度對照組相比，P＜0．01);5×10－6mol/L 的 VIP能誘導大鼠腹腔肥大細胞組胺釋放率明顯增加(與0濃度對照組相比，P ＜0．05)，且隨濃度增大至5×10－5mol/L時，大鼠腹腔肥大細胞的組胺釋放量進一步增加，呈劑量效應關系。所有濃度的CGRP不能引起大鼠腹腔肥大細胞組胺釋放率明顯改變(與0濃度對照組相比，各組 P ＞0．05)。

2．2 VIP、CGRP對大鼠肥大細胞45Ca攝取的影響5×10－7mg/L 48/80復合物可引起大鼠腹腔肥大細胞45Ca攝取明顯增加(與0濃度對照組相比，P ＜0．01);5×10－6mol/L VIP可誘導大鼠腹腔肥大細胞45Ca攝取明顯增加(與0濃度對照組相比，P＜0．01);且隨濃度的增加45Ca攝取量也明顯增加。各濃度CGRP組大鼠肥大細胞45Ca攝取量未見明顯增加(與0濃度對照組相比，各組 P＞0．05)，見圖 2。

圖2 VIP和CGRP對大鼠腹腔肥大細胞45 Ca的影響Fig．2 Effects of VIP and CGRP on 45 Ca influx of RPMCs

圖3 L-8-K對VIP誘導大鼠腹腔肥大細胞組胺釋放的影響Fig．3 L-8-K interacting VIP on histam ine release of RPMCs

圖4 L-8-K對VIP誘導大鼠腹腔肥大細胞45 Ca攝取的影響Fig．4 L-8-K interacting VIP on 45 Ca influx of RPMCs

2．3 L-8-K對CGRP誘導大鼠肥大細胞組胺釋放、鈣攝入的影響 5×10－6mg/L VIP受體抑制劑L-8-K對大鼠肥大細胞組胺釋放、鈣攝取無影響(與0濃度對照組相比，P 分別 ＞0．05)。5×10－6mg/L L-8-K處理大鼠肥大細胞后，其對5×10－6mol/L VIP和5×10－7mol/L VIP誘導的組胺釋放和45Ca攝取的增加均無明顯影響(與相應濃度的VIP組相比，P分別 ＞0．05)，見圖3、4。

3 討論

肥大細胞是哺乳動物體內組胺貯存的主要場所，而在肥大細胞中組胺幾乎全部儲存于其分泌顆粒中。因此，測量大鼠肥大細胞組胺的釋放量，可以作為促顆粒釋放物質促進肥大細胞脫顆粒的重要指標［4，5］。48/80 復合物是一種 N-甲基-p-甲氧苯乙胺-甲醛大分子聚合物，其具有強力的促進肥大細胞脫顆粒作用［6］。研究顯示，48/80復合物分子中含有大量的陽性電荷，其不通過受體、直接作用于肥大細胞細胞膜上的G蛋白，通過一系列復雜的細胞內信號過程引起肥大細胞的活化、釋放活性物質，引起生理及病理反應。本實驗顯示5×10－7mg/L 48/80復合物可引起大鼠腹腔肥大細胞中釋放顆?；钚晕镔|，促進鈣攝入。

圖1、2顯示，5×10－6mol/L濃度的VIP可明顯促進大鼠腹腔肥大細胞釋放組胺和鈣攝入，且隨VIP濃度升高而升高;各濃度的CGRP則無促進肥大細胞釋放組胺和鈣攝取的作用。肥大細胞膜上是否具有神經多肽的受體、以及神經多肽是否通過受體作用于肥大細胞使其脫顆粒一直是人們爭議的問題［3，4］。在組織中，一般神經多肽是在 pmol/L 水平上與受體結合而產生作用，然而神經多肽均在較高水平(μmol/L)促進肥大細胞脫顆粒［6］。研究認為，帶有堿性陽離子氨基酸殘基的神經多肽通過非受體依賴的方式，直接作用于肥大細胞膜上的G蛋白，經過G蛋白介導的磷脂酶C的活化，誘發(fā)鈣離子的內流，導致肥大細胞內結構重排，進一步引起肥大細胞脫顆粒。在這一過程中，神經多肽分子中堿性氨基酸殘基所帶陽電荷數量、精氨酸殘基數量、及多肽分子構型具有重要的作用［6，7］。VIP是由28個氨基酸殘基組成的肽，其分子中具有6個堿性氨基酸殘基、1個精氨酸殘基、2個酸性氨基酸殘基，共顯示4個陽電荷;CGRP是37氨基酸殘基的多肽，其分子中含有4個堿性氨基酸殘基、2個精氨酸殘基、2個酸性氨基酸殘基，共顯示2個陽電荷;本研究證實CGRP無誘導肥大細胞鈣離子內流和脫顆粒的作用、表明神經多肽在促進大鼠肥大細胞功能活動時，除了需有陽電荷和精氨酸外，復雜的分子結構也是重要因素。

L-8-K是一種強力的VIP受體結合抑制劑，它可以抑制VIP引起的神經節(jié)細胞的功能活動［8］。本實驗圖3、4顯示，L-8-K對VIP誘導的大鼠腹腔肥大細胞鈣攝取、組胺釋放均無影響，這進一步說明了VIP誘導的大鼠腹腔肥大細胞脫顆粒是非受體依賴的。

本文研究結果提示，VIP是通過非受體途徑誘導大鼠腹腔肥大細胞內cAMP水平降低和鈣內流增加，引起肥大細胞脫顆粒釋放組胺，產生生物學效應;且具有劑量效應性;CGRP對大鼠腹腔肥大細胞無誘導活化作用。此結果顯示，不同的神經多肽對大鼠肥大細胞的功能調節(jié)作用是不同的，展示了肥大細胞與神經系統聯系的多樣性。

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