杜聯(lián)峰 徐崗村 孫萬邦 王宜峰 王勝香 羅軍敏 姚新生 夏 嬙 楊 瑞 余 妍

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)/貴州省免疫學研究生教育創(chuàng)新基地，珠海 519041)

空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni，CJ)為人及動物消化道共同易感菌［1］，目前CJ感染已成為全球范圍內急性胃腸炎常見的病因之一［2］。CJ感染除引起急性胃腸炎外，還與格林－巴利綜合征［3－6］(Guillain－Barrésyndrome，GBS)有非常密切的關系，是導致兒童發(fā)生急性遲緩性癱瘓的重要病因，目前尚無有效的預防和治療措施。本室前期研究空腸彎曲菌重組蛋白PEB1免疫小鼠后可誘導產生較高滴度特異性抗體和致敏淋巴細胞，證明PEB1重組蛋白具有良好的生物免疫活性［7，8］。由于基因疫苗成本低，能誘導體液免疫和細胞免疫，被廣泛運用于感染性疾病和腫瘤免疫治療［9－11］。本研究以空腸彎曲菌peb1A基因為靶點，構建空腸彎曲菌核酸疫苗pcDNA3．1(－)－peb1A，采用不同免疫程序免疫昆明小鼠后檢測其抗體滴度，初步評價疫苗的生物免疫活性和免疫程序，為空腸彎曲菌DNA疫苗的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 材料 PCR試劑盒、各種限制性內切酶、T4DNA連接酶、DNA標準 Marker 等購自TAKARA公司。PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒、質粒小量抽提試劑盒和NC膜等購自上海生工生物有限公司。jetPEITM轉染試劑盒購自達科為生物技術有限公司。質粒大量抽提試劑盒購自QIAGEN公司。HRP－羊抗大鼠IgG、IgM購自北京博奧森生物技術有限公司。

1．2 實驗動物 昆明鼠180只，雄性，每劑量組30只，6～8周齡，20～25 g/只，購于遵義醫(yī)學院動物實驗中心。

1．3 表達質粒、工程菌株、細胞和蛋白 質粒pcDNA3．1(－)，含有氨芐青霉素(Amp)和潮霉素(Hygromysin)抗性，全長5．4 kb，為Invitrogen公司產品;重組質粒PET28a(+)－peb1A，E．coli JM109 細菌，E．coli菌株DH5α和COS－7細胞為本室保存;CJ標準株(編號CF－1)28～31 kD外膜蛋白由本室分離純化提供，置于 －80℃保存［8］。

1．4 重組質粒 pcDNA3．1(－)－peb1A 的構建 以重組質粒pET28a(+)－peb1A為模板亞克隆peb1A，設計 如 下 引 物:上 游5'－CCgAATTCACCATgggCAg－CAgCCATCAT－3'，下 游 為5'－CgCAAgCTTTTATAAACCCCATTTTTTCgCT－3'。PCR擴增peb1A基因。擴增條件為94℃變性4分鐘，然后94℃變性30秒，53℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，最后1個循環(huán)結束后再以72℃延伸8分鐘，共30個循環(huán)?；厥占兓康钠?。用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切目的片段與pcDNA3．1(－)，回收純化后進行DNA連接反應。連接產物轉化感受態(tài)細胞DH5α，應用氨芐青霉素抗性平板篩選，將重組質粒進行酶切，測序鑒定。

1．5 重組質粒轉染細胞及其表達產物鑒定 將處于對數生長期的COS－7細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，加入重組質粒 pcDNA3．1(－)－peb1A 與 jetPEI的混合物，37℃，5%CO2培養(yǎng)48小時。轉染細胞培養(yǎng)48小時后，收集轉染細胞，PBS洗滌細胞2次后，加100μl含PMSF的RIPA裂解液裂解細胞30分鐘，離心取上清液，進行SDS－PAGE電泳和 Western blot分析，其中Anti－His Tag抗體為一抗，羊抗小鼠IgGHRP為二抗，采用HRP－DAB底物顯色試劑盒檢測。

1．6 免疫分組及免疫程序 免疫接種途徑、劑量:接種前觀察昆明小鼠生活狀態(tài)5天，生活狀態(tài)正常，免疫前2天于注射處先注射0．25%利多卡因50μl/腿，免疫時于小鼠股四頭肌一點注射，每只小鼠100μl，實驗組疫苗的DNA含量為100μg，空載體組疫苗DNA含量為100μg，生理鹽水組注射100 μl。每劑量組均為30只小鼠。免疫程序A方案(短程)見表1，免疫程序方B案(長程)見表2。

2 結果

2．1 重組真核表達載體酶切鑒定結果 隨機挑取傳化成功的單菌落，抽提質粒，經HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，電泳后得到一個位于812 bp處的小片段和一個位于大小位于5 427 bp處的大片段，表明PCR擴增出的peb1A小片段已經成功插入到質粒pcDNA3．1(－)的多克隆位點中 (圖1)。以T7啟動子為引物進行序列測定，經軟件分析結果顯示獲得了正確的peb1A基因序列，插入片段閱讀框正確，質粒構建成功。

2．2 重組質粒在COS－7細胞中的表達 重組質粒和 pcDNA3．1(－)轉染真核細胞 COS－7， Western blot鑒定，重組質粒 pcDNA3．1(－)－peb1A 轉染的 COS－7細胞中檢測到了一條特異條帶，相對分子量在28kD左右，而轉染空質粒細胞中則沒有條帶，結果見(圖2)。

表1 CJ p cDNA3．1(-)-peb1A免疫分組及免疫程序A方案Tab．1 The immune method of CJ pcDNA3．1(-)-peb1A on themice(A)

表2 CJ pcDNA3．1(-)-peb1A免疫分組及免疫程序B方案Tab．2 The immune method of CJ pcDNA3．1(-)-peb1A on themice(B)

2．3 DNA疫苗免疫接種一般情況觀察結果 實驗動物免疫接種后，各免疫組動物精神狀況良好，進食、大便情況正常，體重較免疫前稍有增加，皮毛光滑，局部注射部位無硬結、潰爛、出血，未見死亡。

圖1 重組質粒pcDNA3．1(-)-peb1A的雙酶切鑒定Fig．1 Restrictive enzyme digestion analysis of recombinant p lasm id pcDNA3．1(-)-peb1A

圖2 重組質粒轉染COS-7細胞的W estern blot鑒定結果Fig．2 The results of Western blot for COS-7 cells transfected with plasm id pcDNA3．1-peb1A

小鼠血清IgG水平檢測(B方案，見表4):①裸DNA組IgG水平與兩對照組比較，第15天和第25天明顯增高(P＜0．05)，兩對照組之間無統(tǒng)計學差異(P＞0．05)。②實驗組小鼠血清IgG水平，第25、35、45天與第15天比較，呈逐漸下降趨勢。

小鼠血清IgG抗體最高OD值比較(A方案與B方案):小鼠血清IgG水平A免疫方案第20天達到最高值，B免疫方案第15天達到最高值。對兩免疫方案小鼠血清IgG最高OD值進行比較，結果顯示(表5):裸DNA組A免疫方案第20天均高于B免疫方案第15天，有顯著性差異(P＜0．05)。

表3 CJ pcDNA3．1(-)-peb1A免疫小鼠后血清IgG抗體OD值測定結果(A方案)Tab．3 OD values of the serum IgG antibody levels in mice after immunized with CJ pcDNA3．1(-)-peb1A(Program A)

表4 CJ pcDNA3．1(-)-peb1A疫苗免疫小鼠后IgG抗體OD值測定結果(B方案)Tab．4 OD values of the serum IgG antibody levels in miceafter immunized with CJ pcDNA3．1(-)-peb1A(Program B)

表5 A、B兩免疫方案小鼠血清IgG抗體最高OD值比較Tab．5 Comparison between immune program A and B of themax IgG OD value

2．5 小鼠血清IgM抗體水平變化檢測 A免疫方案血清IgM抗體水平檢測，結果顯示(見表6):①裸DNA組IgM水平與兩對照組比較，第10天明顯增高，有顯著性差異(P＜0．05)。②實驗組小鼠血清IgM水平，第20、30天與第10天比較，逐漸降低。

B免疫方案血清IgM抗體水平檢測，結果見表7:①裸DNA組IgM水平與兩對照組比較，第15天明顯增高，有顯著性差異(P＜0．05)。②實驗組小鼠血清IgM水平，第25、35、45天與第15天比較，逐漸降低至對照組水平。

A免疫方案與B免疫方案血清IgM抗體最高OD值比較:A免疫方案中，小鼠血清IgM水平第10天達到最高值，B免疫方案第15天達到最高值，對兩免疫方案小鼠血清IgM抗體最高OD值進行比較，結果見表8:裸DNA組第10天高于第15天，但是無顯著性差異(P＞0．05)。

表6 CJ pcDNA3．1(-)-peb1A疫苗免疫小鼠后血清IgM抗體OD值測定結果(A方案)Tab．6 OD values of the serum IgM antibody levels in mice after immunized with CJ pcDNA3．1(-)-peb1A(Program A)

表7 CJ pcDNA3．1(-)-peb1A疫苗免疫小鼠后血清IgM抗體OD值測定結果(B方案)Tab．7 OD values of the serum IgM antibody levels in mice after immunized with CJ pcDNA3．1(-)-peb1A(Program B)

表8 A、B免疫方案小鼠血清IgM抗體最高OD值比較Tab．8 Comparison between immune program A and B of themax IgM OD value

3 討論

DNA疫苗具有制備簡單、成本較低、使用簡單;其在體內可長期表達抗原蛋白，產生持久應答;質粒載體免疫原性低等優(yōu)點［12，13］。自上世紀90年代初問世以來，已在多種疾病的防治研究中顯示出巨大的應用潛力，但是裸DNA疫苗接種存在劑量偏大、生物利用度低、持續(xù)時間不夠長等缺點。主要因為裸DNA疫苗注射給藥后，經過細胞間質和細胞質的停留直至轉錄期間，絕大多數會被核酸酶降解失活。為了增強DNA疫苗的免疫保護效果，已進行的探索包括對保護性抗原、表達載體、免疫佐劑、免疫途徑等策略的優(yōu)化［14－17］。

研制基因疫苗的前提和關鍵是候選基因的確定和獲得。近年對CJ致病機制和相關致病基因的研究發(fā)現(xiàn):由peb1A基因編碼表達的PEB1蛋白存在于98%CJ菌體表面，具有十分穩(wěn)定而保守的免疫原性［18，19］。鑒于該蛋白在CJ致腸道感染中的特殊重要性，且其編碼基因非常保守，我們選用peb1A基因作為DNA疫苗的抗原基因?；虮磉_載體的選擇對基因轉染能否成功也很關鍵，pcDNA3．1(－)能使外源基因在哺乳動物細胞中獲得瞬時或穩(wěn)定的表達，是一個理想的真核質粒表達載體。COS－7細胞瞬時表達系統(tǒng)是迅速把克隆化基因在哺乳動物細胞上表達的常用方法。因此，我們選擇peb1A基因為目的抗原基因，構建了重組質粒 pcDNA3．1(－)－peb1A。重組質粒經雙酶切、PCR和 DNA測序鑒定，并證實構建成功，轉染到真核細胞COS－7，免疫印跡技術檢測重組質粒在 COS－7細胞中較好的表達。

本實驗采用的肌肉注射法是目前基因疫苗免疫最常用的方法，對于空腸彎曲菌這種胞外菌的感染，主要依靠體液免疫特異性抗體殺滅細菌、中和毒素來發(fā)揮免疫保護作用。在本實驗中，CJ基因疫苗免疫小鼠后，裸DNA組與空載體和NS對照組比較，均誘導產生了一定滴度的特異性IgM和IgG，說明CJ基因疫苗具有一定的免疫原性，能誘發(fā)小鼠機體產生特異性抗體。

本研究成功構建空腸彎曲菌peb1A基因真核表達載體并在 COS－7細胞中正確表達。CJ pcDNA3．1(－)－peblA 疫苗具有免疫原性，在同一劑量以短程的免疫程序和長程的免疫程序進行比較，結果肌肉注射方式，短程免疫效果較理想。疫苗接種后介導特異性IgM和IgG抗體應答與一般疫苗免疫應答規(guī)律相同。本研究結果為進一步研究空腸彎曲菌DNA疫苗能否使實驗動物產生有效的免疫保護力，降低感染發(fā)生率和死亡率，提供了新的實驗依據。

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