賀霄羽,熊鶯,孫 午
(1、南昌市三三四醫(yī)院,江西 南昌 330024;2、九江市第一人民醫(yī)院檢驗科,江西 九江 332000)
肺癌是常見的導致死亡的惡性腫瘤之一,在我國肺癌死亡占癌癥死亡病因的第3 位,且發(fā)病率有逐年增加的趨勢。肺癌分為小細胞肺癌(SCLC,15%~25%)和NSCLC(NSCLC,75%~85%),而NSCLC 占到原發(fā)肺癌的80%~85%。肺癌是一種多基因遺傳病,目前已發(fā)現很多NSCLC 相關基因,如RAS 基因家族、MYC 基因家族、ERBB 基因家族、P53、RB等[1],研究發(fā)現體內眾多免疫細胞和腫瘤細胞分泌的多種生長因子和細胞因子在正常組織內不表達或痕量表達,而在腫瘤尤其是惡性腫瘤有表達。本研究可推測NSCLC 患者外周血中檢測到IL-13Rα2 蛋白的表達。IL-13Rα2 基 因(IL13RΑ2)位于Xq13.1-q28,共有九個外顯子,其中第七外顯子上有一個cSNPs(rs17095919),我們已知雖然吸煙是肺癌發(fā)病的高風險因素,但只有10%~15%的吸煙者最終發(fā)展成為肺癌,說明了個體基因差異性對肺癌的易感性起了重要作用。本實驗主要研究這個cSNPs 是否與NSCLC 易感性相關,為NSCLC 早期診斷提供理論依據。
1.1 材料 550型號微孔板酶標儀(伯樂太平洋有限公司);Real-time PCR 試劑(全式金公司);ELISA試劑盒(美國R&D 公司);實時熒光定量PCR 儀(達安7600);生物安全柜(復星公司)。
1.2 方法 50例原發(fā)性肺癌患者為2011年3月至2012年3月在南昌市三三四醫(yī)院和九江市第一人民醫(yī)院胸外科進行手術治療的患者,術前未行化療和放療,所有的標本均經組織病理學確診為原發(fā)性肺癌。50個無腫瘤病史和體征的正常對照隨機選自江西地區(qū)例行體檢的健康人群。標本采集及外周血白細胞DNA的提取所有研究個體均采集外周靜脈血5ml,經枸櫞酸鈉抗凝,4℃冰箱保存。
1.2.1 ELISA 法檢測NSCLC 病例組與健康對照組之間靜脈血IL-13Rα2 蛋白表達差異。
1.2.2 采血后一周內以蛋白酶K 消化-飽和氯化鈉鹽析法提取外周血白細胞DNA。
1.2.3 應用針對C和T等位基因的Taqman 探針對基因型鑒定,分析NSCLC 病例組和健康對照組IL13RΑ2 SNP 位點的基因型。IL13RΑ2 rs17095919(C256T) 引物為:Forward primer 5’-ACCTTTGCCGCCAGTCTATCTTAC -3’;Reverse primer 5’ -TGTCGGGTTTCATTTGTTGTTTTC-3’,針對C和T等位基因的Taqman 探針。反應體系總體積為25μl,包括模板DNA2μl,10×緩沖 液2.5μl,250 mmol/L MgCl20.3μl,10 mmol/L dNTP 0.7μl,正向引物0.5μl,反向引物0.5μl,特異性探針0.5μl。余量用蒸餾水補足。反應條件:95℃15 min,接著是45個循環(huán):95℃變性20 s,58℃退火20 s,72 ℃延伸20 s。直接觀察實時熒光定量PCR的反應曲線,擴增曲線發(fā)生抬高的證實為存在與Taqman 探針對應的等位基因。
1.3 統(tǒng)計學分析 實驗數據使用SPSS13.0軟件進行數據分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 ELISA 方法檢測結果可以發(fā)現正常人幾乎無IL-13Rα2 蛋白的表達,NSCLC 病例組IL-13Rα2蛋白水平達到5.7ng/ml(SD=0.34),與健康對照組之間相比靜脈血IL-13Rα2 蛋白表達明顯增加(P<0.05)。
2.2 NSCLC 患者和健康對照組的IL13RΑ2的等位基因頻率分布見表1,等位基因頻率分別為49.0%、51.0%和48%、52%,經統(tǒng)計學分析,無顯著性差異。在兩組人群中,等位基因C和T 頻率均符合Hardy-Weinberg 平衡法則。NSCLC 患者和健康對照組的IL13RΑ2的基因型分布見表2,可以發(fā)現NSCLC 患者IL13RΑ2的基因型C/T與健康對照存在顯著差異,因此可以認為IL-13RA2的C/T 基因型與NSCLC 易感性相關,其他基因型在組間分布差異無統(tǒng)計學意義,與NSCLC 易感性無關。
表1 等位基因頻率分布
我國肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年升高,位居城市人口中惡性腫瘤之首。表皮生長因子受體(EGFR)在多種惡性腫瘤的發(fā)病和加重過程中起了重要作用,在臺灣人群中EGFR 基因的多態(tài)性與不吸煙的女性肺腺癌患者發(fā)病過程高度相關[2]。國內對肺癌診斷的聯合指標進行了廣泛的研究,包括TPS、NSE、CEA、LunXmRNA 及血清骨保護素等指標在肺癌診斷中價值[3-5]。韓國的1項研究表明了轉化生長因子TGF-β 基因SNPs與肺癌的發(fā)病和預后的關系,A-1572G,C-509T和T+869C 在雜合子基因型攜帶者的重度吸煙者肺癌發(fā)病風險高[6]。這些眾多研究表明細胞因子及其受體基因表達的多態(tài)性與肺癌的發(fā)病風險增加和病程發(fā)展高度相關。IL-13 主要由激活的輔助T 淋巴細胞(Th2)細胞、肥大細胞、自然殺傷細胞和嗜堿性粒細胞產生,它是一種多功能的細胞因子,起著調節(jié)炎癥、黏液產生、組織重建和纖維化的作用。我們已經發(fā)現IL-13的高親和力受體IL-13Rα2 過度表達在許多種固體癌細胞上如小兒腦瘤、惡性膠質瘤、卵巢癌、星形細胞瘤等。這說明IL-13Rα2的表達與癌癥高度相關。IL-13的高親和力受體:IL-13 受體α2 在正常組織表達很低,O'Toole M等人用一種獨特ELISA 方法研究證實正常人血漿中無IL-13Rα2表達[7],卻在腫瘤上有著高表達。Daines MO等人研究證實IL-13Rα2 有三種形式:細胞膜表面、細胞內和一種可溶形式 (sIL-13Rα2),IL-13Rα2 蛋白主要存在細胞內,膜表面IL-13Rα2 釋放于介質中即表現為sIL-13Rα2,并且胞質內IL-13Rα2 不斷運輸至細胞表面補充膜表面IL-13Rα2[8]。而sIL-13Rα2的表達可被炎癥反應[9]、寄生蟲感染[10]、變態(tài)反應和激惹[11]所誘導,本實驗也證實了sIL-13Rα2與NSCLC 有關。因為cSNPs可以進行疾病的遺傳連鎖分析及關聯分析,用于疾病易感基因定位,本研究進一步證實IL-13RA2 基因cSNPs:rs17095919(IL13RΑ2 第七外顯子第一密碼子256 位置C/T)SNP與NSCLC的發(fā)病風險相關。其中NSCLC組的C/T 雜和基因型頻率明顯高于對照組,其他基因型在各組間分布差異無統(tǒng)計學意義,提示IL-13RA2 基因C/T 基因型為NSCLC 易感基因型,IL-13RA2 其他基因型與NSCLC 無關。遺傳學家認為,對復雜多基因疾病的研究,要綜合考慮種族、樣本量、實驗手段、統(tǒng)計方法,甚至不同疾病的生理、病理等多方面因素的考慮,才能得到科學的、可信的結論。因此我們通過對IL-13RA2 單核苷酸多態(tài)性與NSCLC的發(fā)生機制深入研究,確定了IL-13RA2 SNPs的C/T 基因型與NSCLC的強相關關系,對NSCLC的診斷和治療將更有針對性,甚至做到個體化。同時建立有效的預警系統(tǒng)后,達到有效的一級預防目的,將大大減少NSCLC 患者的發(fā)病率,從而降低NSCLC 患者的診療費用。NSCLC 鱗癌和腺癌IL13RΑ2 單核苷酸多態(tài)性之間的相關性在本研究中未發(fā)現顯著性差異,但有待進一步研究。
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