蟾皮藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究＊

曹 蔚 李 瑛 段林瑞 劉媛媛 王 凱 王四旺

第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系天然藥物學(xué)教研室（西安710032）

蟾皮為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans Cantor）或黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus Schneider）的干燥皮，最早記載于《本經(jīng)逢原》，自古沿用至今。習(xí)稱“蛤吧皮”、“癩蟆皮”、“蟾蜍皮”、“蛤蟆皮”等。具有清熱解毒，利水消脹之效，用于癰疽、腫毒、瘰疬、腫瘤、疳積腹脹等?！侗静菥V目》中記載：“蟾蜍其皮為元黽，主治疸疬惡瘡、破癥結(jié)、腫毒、腸頭挺出和一切惡腫等”；《中藥大辭典》中記載：“蟾皮清熱解毒、消腫止痛，軟堅(jiān)散結(jié)”?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，蟾皮水提物具有抗腫瘤作用[1]，脂溶性組分具有抑制心肌細(xì)胞膜ATP酶等作用[2]。臨床用于慢性氣管炎、惡性腫瘤及癰疽瘡瘍等治療。近年來有關(guān)蟾皮制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究報(bào)道較多，但《中國(guó)藥典》尚未收載蟾皮；蟾皮藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分等常規(guī)項(xiàng)目的測(cè)定，活性成分的定性鑒別也未見報(bào)道。這些項(xiàng)目的含量與藥物的臨床療效、穩(wěn)定性和安全性有密切關(guān)系。本研究對(duì)蟾皮的水分、總灰分、酸不溶性灰分等檢測(cè)項(xiàng)目及活性成分的定性鑒別、定量測(cè)定進(jìn)行較為全面的研究，為建立和完善蟾皮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)的參考。

1 材料

1.1 藥材 3批蟾皮藥材采集自陜西省內(nèi)不同地區(qū)（漢中市、西安周至縣和藍(lán)田縣），2批購(gòu)于河北安國(guó)、安徽亳州藥市，經(jīng)本教研室鑒定為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥皮。

1.2 儀器 LC－2010AHT高效液相色譜儀（日本島津公司）；GZX－DH型電熱恒溫干燥箱（上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠）；BL310型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；SX－4－10型箱式電阻爐控制箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；SHZ－D（III）型循環(huán)水真空泵（天津華鑫儀器有限公司）；SK250LHC超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；電子恒溫水浴鍋（北京化玻醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 試劑 華蟾酥毒基對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)：200605）；酯蟾毒配基對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)：200507）；乙腈為色譜純；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 理化鑒別 取本品粉末0.1g，加甲醇5 mL，浸泡1h，濾過，濾液加對(duì)二甲氨基苯甲醛固體少量，滴加硫酸數(shù)滴，即顯藍(lán)紫色。

取本品粉末0.1g，加三氯甲烷5mL，浸泡1h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)哟佐倭渴谷芙?，滴加硫酸，初顯藍(lán)紫色，漸變藍(lán)綠色。

2.2 薄層鑒別 取本品粉末0.5g，加乙醇10 mL，加熱回流30min，濾過，濾液置10mL量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取華蟾酥毒基對(duì)照品加乙醇分別制成每1mL含0.5mg的溶液，取酯蟾毒配基對(duì)照品加乙醇分別制成每1mL含0.2mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。用薄層色譜（TLC）法試驗(yàn)，吸取上述四種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－三氯甲烷－丙酮（4︰3︰3）為展開劑，展開，取出，晾干，紫外下檢測(cè)，如圖1。再噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的一個(gè)綠色及一個(gè)紅色斑點(diǎn)。

圖1 蟾皮的TLC

2.3 水分及灰分測(cè)定

2.3.1 水分 按照《中國(guó)藥典》（2010年版）一部附錄IX H第一法進(jìn)行測(cè)量[3]。稱取蟾皮粉末（過2號(hào)篩）約2g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，打開瓶蓋在100～105℃干燥5h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30min，精密稱定，再在上述溫度干燥1h，冷卻，稱重，至兩次稱重的差異不超過5mg為止。根據(jù)減失的重量，計(jì)算供試品中含水量（%）。結(jié)果見表1。5批蟾皮藥材中水分含量平均值為10.99%。

2.3.2 總灰分 按照《中國(guó)藥典》（2010年版）一部附錄IX K第一法進(jìn)行測(cè)量[1]。分別稱取蟾皮粉末約3g，置灼燒至恒重的坩堝中，放入電阻爐中，緩緩灼燒，根據(jù)殘?jiān)闹亓?，?jì)算供試樣品中總灰分的含量，結(jié)果見表1。5個(gè)蟾皮樣品中總灰分量平均值為13.21%。

2.3.3 酸不溶性灰分 供試品先按2.3.2的方法步驟測(cè)定其總灰分，然后取所得的灰分，在坩堝中加入10mL稀鹽酸，水浴加熱10min，用50℃左右的熱水5mL將表面皿沖洗，沖洗液并入坩堝中，用無灰濾紙過濾，用熱水沖洗，殘?jiān)B同濾紙一同放入坩堝中，干燥，放入電阻爐中，緩緩灼燒，直到溫度升至550℃，再灼燒8h，關(guān)閉電阻爐，過夜，取出坩堝，放置干燥器中30min，根據(jù)殘?jiān)闹亓?，?jì)算供試樣品中灰分的含量，結(jié)果見表1。5個(gè)測(cè)試樣品中酸不溶性灰分含量平均值為4.58%。

表1 蟾皮水分、總灰分、酸不溶灰分測(cè)定結(jié)果（n＝3）

2.4 華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18（250 mm4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈－0.5%磷酸二氫鉀溶液（50∶50，用磷酸調(diào)PH 3.2）；檢測(cè)波長(zhǎng)：296nm；流速：1.0mL·min－1；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μL。理論塔板數(shù)按華蟾酥毒基峰、脂蟾毒配基峰計(jì)算應(yīng)分別不低于4000。色譜見圖2。

圖2 蟾皮的HPLC

2.4.2 供試品溶液的制備 分別取蟾皮藥材，粉碎使其過2號(hào)篩。取細(xì)粉約500mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20mL，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取0.355mg·mL－1的華蟾酥毒基對(duì)照品溶液和0.215mg·mL－1的脂蟾毒配基對(duì)照品溶液，等體積混合，并梯度稀釋兩倍，制成華蟾酥毒基濃度為177.50、88.75、44.38、22.19、11.09、5.55、2.77μg·mL－1，脂蟾毒配基濃度為107.50、53.75、26.88、13.44、6.72、3.36、1.68μg·mL－1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取20μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定。以濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得華蟾酥毒基的回歸方程為：Y ＝17 478X＋14 095（r＝0.999 9），脂蟾毒配基的回歸方程為：Y＝18 863X＋9 439.9（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的濃度分別在2.77～177.50、1.68～107.50μg·mL－1范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.4.4 精密度試驗(yàn) 取蟾皮樣品連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，華蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面積的RSD分別為0.31%、0.30%。表明儀器精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一產(chǎn)地蟾皮樣品按2.4.2項(xiàng)下操作方法制備5份樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，華蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面積的RSD分別為0.31%、1.01%。表明本實(shí)驗(yàn)所用的方法重復(fù)性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一產(chǎn)地蟾皮樣品按2.4.2項(xiàng)下操作方法制備樣品溶液，分別于0、1、2、4、8、12h測(cè)定峰面積，結(jié)果，供試品溶液中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基峰面積的RSD分別為0.65%、0.87%。表明華蟾酥毒基、脂蟾毒配基在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 加樣回收率 精密稱取已知含量的蟾皮樣品9份，精密加入不同量的對(duì)照品，按照2.4.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。平均回收率為98.80%，RSD為2.81%。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.8 樣品含量測(cè)定 按上述色譜條件測(cè)定5批蟾皮中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量，見表3。

表3 蟾皮藥材中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量

3 討 論 蟾酥（Venenum bufonis）為蟾蜍耳后腺及皮膚腺的干燥分泌物，蟾皮為蟾蜍去除內(nèi)臟后的干燥表皮。蟾酥、蟾皮及其制劑均在臨床廣泛應(yīng)用，但化學(xué)成分及功能主治卻不盡相同。蟾酥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》，但尚未收載蟾皮。蟾皮收載于《江西省地方藥材標(biāo)準(zhǔn)》及《江蘇省地方藥材標(biāo)準(zhǔn)》，但其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)簡(jiǎn)單。故本研究參照《中國(guó)藥典》（2010年版）蟾酥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)蟾皮藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了進(jìn)一步的補(bǔ)充研究，為本品炮制及含制劑的生產(chǎn)與研發(fā)提供參考。

根據(jù)《中國(guó)藥典》（2010版）一部中蟾酥藥材水分含量測(cè)定的方法，考慮到目前未有蟾皮中含有揮發(fā)油的文獻(xiàn)報(bào)道，而《中國(guó)藥典》水分含量測(cè)定第一法（烘干法）測(cè)定水分方法簡(jiǎn)單，操作易行，因此本文采用此法對(duì)蟾皮的水分進(jìn)行測(cè)定。

在本品的理化鑒別試驗(yàn)中，參照文獻(xiàn)[4]對(duì)含有2’6－去氧糖組成的強(qiáng)心苷類成分進(jìn)行顯色反應(yīng)，反應(yīng)迅速、顏色明顯。此外，筆者還將供試溶液點(diǎn)于濾紙片上，干燥后，噴對(duì)二甲氨基苯甲醛試劑（1g對(duì)二甲氨基苯甲醛溶于l00mL乙醇中，再加25mL鹽酸混合而成），于90℃加熱半分鐘可顯灰紅色斑點(diǎn)，因重現(xiàn)性差，故不推薦列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

蟾皮中富含蟾毒配基類化合物。其中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量相對(duì)較高。故在我們的研究中選擇以華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量做為蟾皮的檢測(cè)指標(biāo)，參考《中國(guó)藥典》（2010年版一部）蟾酥項(xiàng)下方法進(jìn)行鑒別，以期達(dá)到控制蟾皮質(zhì)量的目的。但由于大多供試品中酯蟾毒配基未檢出。結(jié)合含量測(cè)定結(jié)果，考慮到蟾皮中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量遠(yuǎn)低于蟾酥的實(shí)際，故不推薦華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的薄層鑒定列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

[1]孫凌飛，申文江.蟾皮提取液對(duì)腎癌細(xì)胞凋亡及Fas、FasL和bcl－2表達(dá)的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊，2000，2（5）：32－33.

[2]陳才法，李景輝，鄭維發(fā)，等.蟾酥、蟾皮、蟾衣提取物對(duì)心肌細(xì)胞膜 ATP酶的影響[J].四川動(dòng)物，2008，27（3）：393－395.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典（一部）[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：附錄52.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典（一部）[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：360.7