河池學院化學與生命科學系 何海燕 羅萍萍 蘭景麗 覃擁靈＊

酵母含有易被畜禽吸收的必需氨基酸、B族維生素、礦物質(zhì)元素和微量元素等成分，是飼料蛋白質(zhì)的有效補充物，作為蛋白質(zhì)飼料添加到配合飼料中，具有和魚粉相同的功效 （王定昌和賴榮婷，2002；劉曉蘭等，2002）。隨著我國釀酒行業(yè)的發(fā)展，葡萄種植業(yè)也得到快速的發(fā)展，其年產(chǎn)量已達500多萬噸，在葡萄加工過程中產(chǎn)生的大量皮渣等副產(chǎn)物，約占葡萄加工總量的25%～30%（張秀玲等，2008；吉宏武，2002）。如何有效利用大量的葡萄廢渣是提高釀酒企業(yè)經(jīng)濟效益，增加產(chǎn)品附加值是迫切需要解決的問題。本研究在前期菌種篩選試驗的基礎(chǔ)上，對葡萄渣發(fā)酵生產(chǎn)高生物量飼料酵母的發(fā)酵工藝進行了試驗研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 啤酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae）編號WS208，前期試驗篩選誘變后保藏菌種（何海燕和覃擁靈，2009）。

1.1.2 材料與試劑 葡萄渣由廣西中天領(lǐng)域酒業(yè)有限公司提供，參照劉曉蘭等（2002）的酸化水解法進行預處理，方法如下：葡萄渣和硫酸（2%）按1∶8 （g/mL）的比例混合，煮沸 30 min 后酸解 24 h，過濾得水解液，在通風廚內(nèi)用氨水中和水解液中的硫酸至pH 5.5備用，生成的硫酸銨作為發(fā)酵氮源。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 HYG-型培養(yǎng)搖床（上海欣蕊自動化設備有限公司）、SPX-150型生化培養(yǎng)箱 （上海躍進醫(yī)療器械有限公司）、SW-CJ-IF型潔凈工作臺 （蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、AE240S型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、TDL-5-A型低速臺式大容量離心機（上海安亭科學儀器廠）、LDZX-50FAS型立式壓力蒸汽滅菌器 （上海申安醫(yī)療器械廠）、G2X-GF 101-2S型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）。

1.1.4 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母膏1.5%，蛋白胨1%，瓊脂 2%；種子培養(yǎng)基：葡萄渣水解液100 mL，另添加硫酸銨0.5%，七水硫酸鎂 0.05%，磷酸二氫鉀0.1%，pH 5.5；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄渣水解液100 mL，另添加硫酸銨1%，七水硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.2%，pH 5.5。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化 保藏菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)48 h活化菌種。

1.2.2 種子擴大培養(yǎng) 接種環(huán)取一環(huán)斜面菌種至種子培養(yǎng)基中，28℃、190 r/min搖床培養(yǎng)48 h。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為100 mL/500 mL三角瓶，接種量10%，28℃、190 r/min搖床培養(yǎng)72 h。

1.3 生物量 （酵母菌體質(zhì)量）測定 發(fā)酵液4000 r/min離心15 min，收集菌體，60～80℃烘干至恒重，稱量并記錄數(shù)值。

1.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗 選取氮源添加量、裝液量、發(fā)酵液初始pH、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時間各因素，研究其對酵母生物量的影響。

1.4.2 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取對酵母生物量影響較大的因素設計正交試驗，研究發(fā)酵條件的最佳優(yōu)化組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果分析

2.1.1 氮源添加量對生物量的影響 試驗設計發(fā)酵液中硫酸銨添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，研究其對生物量的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，當硫酸銨添加量為1.5%時，酵母生物量最高，再增加硫酸銨添加量，生物量不再升高反而降低，原因可能是葡萄渣水解液中已含有一定量的硫酸銨，過高濃度反而抑制了酵母菌體的繁殖。因此，以下試驗硫酸銨添加量為1.5%。

2.1.2 裝液量對生物量的影響 由圖2可知，隨著搖瓶裝液量的增加，菌體繁殖所需的溶解氧供應不足，生物量呈減少的趨勢，其中裝液量為100～200 mL/500 mL時，對酵母生物量的影響并不顯著，當裝液量大于200 mL/500 mL時，則出現(xiàn)急劇遞減現(xiàn)象，在試驗所取數(shù)值范圍內(nèi)，裝液量為150 mL/500 mL時生物量最高。

圖2 裝液量對生物量的影響

2.1.3 發(fā)酵液初始pH對生物量的影響 由圖3可知，發(fā)酵液初始pH在5.0～6.0生物量呈緩慢上升趨勢，但pH高于6.0后，越趨于中性，產(chǎn)物量越少，當pH為6.0時，菌體生物量最大。

2.1.4 發(fā)酵溫度對生物量的影響 由圖4可知，發(fā)酵溫度低于30℃時，生物量隨著發(fā)酵溫度的升高而增加，當發(fā)酵溫度高于30℃后，生物量呈下降趨勢，發(fā)酵溫度為30℃時菌體生物量最高。

2.1.5 搖床轉(zhuǎn)速對發(fā)酵生物量的影響 由圖5可知，生物量隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加而增高，原因是增大搖床轉(zhuǎn)速能增加氧氣溶解從而促進菌體繁殖，搖床轉(zhuǎn)速為210 r/min時生物量最大。

2.1.6 發(fā)酵時間對生物量的影響 由圖6可知，發(fā)酵時間在96 h內(nèi)，生物量隨著發(fā)酵時間的延長而增高，但超過96 h后，生物量反而呈下降的趨勢，原因有可能是產(chǎn)生了次級代謝產(chǎn)物抑制了菌體繁殖或者菌體自溶所致，發(fā)酵時間為96 h時生物量最大。

2.2 正交試驗結(jié)果 根據(jù)以上單因素試驗結(jié)果，選取對生物量影響較顯著4個因素：發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、氮源添加量設計正交試驗，優(yōu)化發(fā)酵的最佳組合，試驗設計和結(jié)果見表1和表2。

由表2可知，R值（極差）的大小排序依次為RB>RA>RC>RD，即發(fā)酵時間對酵母生物量的影響最為顯著，其次是搖床轉(zhuǎn)速，最不顯著的因子是氮源添加量，從表中K值可知最優(yōu)發(fā)酵組合為A3B1C3D1，即搖床轉(zhuǎn)速 200 r/min，發(fā)酵時間 84 h，發(fā)酵溫度32℃，硫酸銨添加量為1.0%，此發(fā)酵組合在正交試驗設計中沒有，根據(jù)此發(fā)酵條件做三平行三重復追加試驗，得到酵母生物量均值為22.17 g/L， 是未優(yōu)化之前生物量 （16.31 g/L）的1.36倍。

表1 因素水平表L9（43）

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果及極差分析

3 結(jié)論

本研究以葡萄渣水解液為唯一碳源發(fā)酵生產(chǎn)高生物量飼料酵母，在發(fā)酵液初始為pH 6.0，裝液量為150 mL/500 mL，接種量為10%，硫酸銨添加量為1.0%，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，發(fā)酵溫度為32℃，發(fā)酵時間為84 h的最優(yōu)發(fā)酵條件下，酵母的生物量可達22.17 g/L，可作為優(yōu)良的蛋白質(zhì)飼料添加劑。

[1]何海燕，覃擁靈.微波誘變選育蛋白飼料酵母高產(chǎn)菌株[J].中國飼料，2009，22：15 ～ 16，19.

[2]吉宏武.葡萄酒廠下腳料的綜合開發(fā)利用途徑 [J].食品研究與開發(fā)，2002，21（1）：29 ～ 32.

[3]劉曉蘭，鄭喜群，婁喜山，等.玉米皮水解液發(fā)酵生產(chǎn)飼料酵母的研究[J].齊齊哈爾大學學報，2002，18（2）：4 ～ 6.

[4]王定昌，賴榮婷.酵母的用途[J].糧油食品科技，2002，10（1）：12 ～ 14.

[5]張秀玲，祝義偉，孫佳平.釀酒后的葡萄渣的綜合利用[J].食品工業(yè)科技，2008，7：284 ～ 288.