許 力，虞雪融，黃宇光

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院麻醉科，北京 100730)

痛覺過敏和觸誘發(fā)痛是神經(jīng)病理性疼痛的突出特點(diǎn)，現(xiàn)有的治療方法效果十分有限［1］。大量研究發(fā)現(xiàn)，前炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)可能在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用。例如，TNF-α作用于坐骨神經(jīng)后可造成傷害性初級(jí)傳入纖維自發(fā)性興奮，并呈劑量依賴;外周神經(jīng)損傷后脊髓背角中 TNF-α表達(dá)增加［2］。此外，TNF-α抑制劑可以緩解慢性壓迫性損傷(chronic constrictive injury，CCI)引發(fā)的痛覺過敏［3］。然而，參與脊髓TNF-α合成過程的信號(hào)傳導(dǎo)精確細(xì)節(jié)，尚未明確。體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞在脂多糖誘導(dǎo)下可以產(chǎn)生大量TNF-α，而這一過程是通過脂多糖激活P38 MAPK通路完成的［4］。小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞，能夠產(chǎn)生釋放多種細(xì)胞因子，包括TNF-α。以往通過多種神經(jīng)病理性疼痛模型證實(shí)，外周神經(jīng)損傷后脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中P38將被激活(激活的 P38形式為磷酸化-P38 MAPK，即 p-P38)［5］。由此可見，TNF-α 與 P38 之間可能存在著重要聯(lián)系，并且在神經(jīng)損傷后的神經(jīng)病理性疼痛形成過程中發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑材料

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量160～200 g(北京維通科華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證SCXK京2003220043)，12 h亮、暗間隔，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。P38抑制劑:4-(4-氟苯)-2-(4-甲磺酰苯)-5-(4-吡啶基)-1 氫-咪唑(SB203580)、抗β-actin抗體(Sigma公司)，蛋白酶和磷酸酶抑制劑的緩沖液、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素、抗TNF-α抗體和ECL發(fā)光試劑盒(Santa Cruz公司)，SDS-PAGE凝膠和醋酸纖維素膜(Bio-Rad公司)，抗磷酸化-P38抗體和抗總-P38抗體(Cell Signaling公司)生物素-親和素 SP試劑盒(Zymed公司)。

1.2 CCI模型建立

經(jīng)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究管理委員會(huì)批準(zhǔn)，118只SD大鼠納入本研究。實(shí)驗(yàn)分組包括:1)空白對(duì)照組(n=14)，2)假手術(shù)組(n=14)，3)CCI手術(shù)后未治療組(n=42)，4)CCI手術(shù)0.9%氯化鈉注射液治療組(n=24)，5)CCI手術(shù)P38抑制劑SB203580治療組(n=24)。第4和第5組，0.9%氯化鈉注射液或SB203580(2 μg，每天兩次)分別于手術(shù)前1天、手術(shù)后第1和第7天，鞘內(nèi)注射入大鼠體內(nèi)，持續(xù)注射7 d。

大鼠在戊巴比妥鈉(40 mg/kg，腹腔注射)麻醉下進(jìn)行CCI模型制作:在顯微解剖鏡下(放大倍數(shù)×40)暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)主干約7 mm，使用4-0羊腸線將坐骨神經(jīng)松結(jié)扎4道，每個(gè)結(jié)相隔1 mm。結(jié)扎僅使坐骨神經(jīng)輕度受壓［6］，然后逐層縫合傷口。沒有進(jìn)行手術(shù)的大鼠作為空白對(duì)照，而假手術(shù)組大鼠僅暴露坐骨神經(jīng)而并未結(jié)扎。

1.3 鞘內(nèi)置管

鞘內(nèi)置管于CCI手術(shù)前進(jìn)行。戊巴比妥鈉麻醉下切除大鼠L6椎體，切開硬腦膜，將PE-10聚乙烯導(dǎo)管置入大鼠蛛網(wǎng)膜下腔約1.5 cm，使其恰好位于脊髓L3-4節(jié)段。小心縫合傷口，固定導(dǎo)管。鞘內(nèi)置管后大鼠休息24 h再進(jìn)行CCI手術(shù)。

1.4 Western blot

各組大鼠分別在CCI術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)(3、7和14 d)麻醉下斷頭處死，快速取出其手術(shù)側(cè)腰膨大，勻漿后每個(gè)電泳道中放入30 μg總蛋白，采用SDSPAGE凝膠分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上。濾膜在室溫下封阻約1 h后，在抗磷酸化-P38(p-P38)抗體、抗總-P38(total-P38)抗體、抗 TNF-α抗體以及抗β-actin抗體中，4℃孵育一夜。所得的印跡經(jīng)二抗孵育1 h，在ECL試劑盒中顯影1 min，后暴露于 X線片上約1～10 min。磷酸化 P38和TNF-α的數(shù)據(jù)分別與各自樣本的β-actin在同一張濾膜上進(jìn)行了內(nèi)對(duì)照。

1.5 免疫組織化學(xué)

使用4%多聚甲醛灌注，小心完整取出大鼠腰膨大，使用固定液固定標(biāo)本3～4 h，然后將標(biāo)本置于25%蔗糖中過夜。冰凍切片機(jī)切取脊髓橫斷漂浮切片(片厚30 μm)，與抗磷酸化-P38抗體孵育，然后染色。

1.6 行為學(xué)分析

在進(jìn)行基礎(chǔ)閾值測定前，大鼠將適應(yīng)2周新的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。大鼠均置于架好的金屬網(wǎng)格墊上。測定腳掌機(jī)械閾值時(shí)，使用力度由0.2～26 g的一系列Von Frey細(xì)絲刺激大鼠后肢腳掌。將能夠引發(fā)大鼠縮足反應(yīng)的最小力度認(rèn)定為機(jī)械閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)［7］。各組大鼠均在手術(shù)前3天、手術(shù)當(dāng)天(手術(shù)前即刻)、以及術(shù)后3、7和14 d測定 MWT。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CCI術(shù)后脊髓P38被激活

CCI術(shù)后第3天開始脊髓背角p-P38水平明顯增高，并持續(xù)大約2周，而總P38(total-P38)水平?jīng)]有明顯變化(圖1)。免疫組化結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，對(duì)照組大鼠脊髓背角p-P38水平明顯低于CCI組大鼠，CCI術(shù)后3 d脊髓背角p-P38染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)量均明顯增加(圖2)。

2.2 CCI誘導(dǎo)脊髓TNF-α合成增加

與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，CCI術(shù)后3、7和14 d脊髓背角TNF-α水平顯著升高(圖3)。

2.3 抑制P38活化能夠緩解CCI誘導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛

與0.9%氯化鈉注射液治療組相比，SB203580預(yù)先給藥組和疼痛早期給藥組，CCI誘導(dǎo)的觸誘發(fā)痛得到顯著緩解，MWT明顯升高(P＜0.05)。然而，當(dāng)CCI誘導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛持續(xù)存在后，即CCI術(shù)后7 d時(shí)再給予上述SB203580鞘內(nèi)治療，則不能有效緩解機(jī)械性觸誘發(fā)痛(圖4)。

2.4 P38抑制劑可以抑制CCI術(shù)后脊髓TNF-α合成

與0.9%氯化鈉注射液治療組相比，SB203580預(yù)先給藥組和疼痛早期給藥組，CCI誘導(dǎo)的脊髓背角TNF-α合成水平明顯下降(P＜0.05)。然而，當(dāng)CCI誘導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛持續(xù)存在后，即CCI術(shù)后7 d時(shí)再給予SB203580治療，則痛閾水平和脊髓TNF-α合成水平均無明顯改變(圖5)。

3 討論

本研究結(jié)果提示，鞘內(nèi)注射SB203580并不影響基礎(chǔ)痛閾，但是預(yù)先或疼痛早期給藥則可明顯降低CCI誘發(fā)的病理性疼痛。然而，當(dāng)疼痛持續(xù)存在后，P38抑制劑則無明顯鎮(zhèn)痛作用。另一項(xiàng)研究采用SNL模型得到了與本研究相似的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)，只有在SNL手術(shù)前向大鼠鞘內(nèi)輸注SB203580才能起到鎮(zhèn)痛作用，而SNL術(shù)后7 d給藥則無效果［8］。

圖1 CCI術(shù)后脊髓背角磷酸化P38 MAPK的Western blot檢測結(jié)果Fig 1 Western blot analysis for P38 MAPK in the dorsal horn of the spinal cord after CCI(±s，n=6)

圖4 不同時(shí)點(diǎn)鞘內(nèi)注射P38抑制劑對(duì)CCI誘導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛的影響Fig 4 The analgesia effect of intrathecal inhibition of P38 on CCI induced mechanical allodynia in different time point(±s，n=8)

本研究結(jié)果提示，CCI能夠誘導(dǎo)脊髓TNF-α合成增加。TNF-α作為一種前炎性因子在病理性疼痛形成過程中發(fā)揮著極其重要的作用:TNF-α注入正常背根神經(jīng)節(jié)和大鼠肌肉均可誘導(dǎo)痛覺過敏;外周或中樞神經(jīng)損傷后，腦和脊髓部位的TNF-α蛋白和mRNA 水平均增加［9－10］。

可見P38和TNF-α在神經(jīng)病理性疼痛中均發(fā)揮著重要作用。本研究通過CCI模型觀察了脊髓中P38與TNF-α合成之間的關(guān)系。在多種神經(jīng)病理性疼痛模型中，外周神經(jīng)損傷后，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞P38將被激活［11］。同時(shí)，脊髓中TNF-α水平也增加。小膠質(zhì)細(xì)胞是脊髓中重要的巨噬細(xì)胞，可以釋放包括IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等在內(nèi)的多種細(xì)胞因子［5］。本研究結(jié)果提示，P38抑制劑可以抑制CCI誘導(dǎo)的脊髓TNF-α合成。因此，推出下面設(shè)想:外周神經(jīng)損傷后，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中P38通路被激活，活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞可以釋放大量細(xì)胞因子，包括TNF-α，從而引發(fā)疼痛。另一項(xiàng)研究證實(shí)了TNF-α與P38關(guān)系的另一面:他們向SNL模型大鼠腹腔內(nèi)注射TNF抑制劑，發(fā)現(xiàn)TNF抑制劑可以抑制P38的活化，從而緩解了因SNL導(dǎo)致的觸誘發(fā)痛［11］。本研究因此得出結(jié)論:在脊髓中，P38活化與TNF-α合成互為因果，一方面活化的P38可以誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)上調(diào)，另一方面大量合成的TNF-α也可以促使P38激活。

圖5 P38 MAPK抑制劑SB203580對(duì)CCI大鼠脊髓TNF-α合成的影響Fig 5 The influence of P38 MAPK inhibitor SB203580 on synthesis of TNF-α in spinal cord of rats with CCI(±s，n=8)

通過分析P38抑制劑的治療窗，本研究考慮P38更多地參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生，而不是發(fā)展。CCI術(shù)后7 d，當(dāng)神經(jīng)病理性疼痛已經(jīng)持續(xù)存在，大量細(xì)胞因子包括 TNF-α、IL-1、IL-6以及大量疼痛介質(zhì)在脊髓中合成釋放［12］。正如前面所述，如此眾多的細(xì)胞因子可能激活P38通路，也有可能同時(shí)激活其他MAPK通路。因此，作為P38特異性抑制劑，SB203580無法在CCI引發(fā)的病理性疼痛持續(xù)存在數(shù)天后發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

綜上，本研究證實(shí)P38抑制劑可以抑制CCI誘導(dǎo)的脊髓TNF-α合成。在CCI誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中，P38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路作為重要因素參與TNF-α合成。

［1］Vorobeychik Y，Gordin V，Mao J，et al.Combination therapy for neuropathic pain:a review of current evidence［J］.CNS Drugs，2011，25:1023 －1034.

［2］Zhang L，Berta T，Xu ZZ，et al.TNF-alpha contributes to spinal cord synaptic plasticity and inflammatory pain:distinct role of TNF receptor subtypes 1 and 2 ［J］.Pain，2011，152:419－427.

［3］Sommer C，Marziniak M，Toyka KV.Etanercept reduces hyperalgesia in experimental painful neuropathy［J］.J Peripher Nerv Syst，2001，6:67 －72.

［4］Nakajima K，Tohyama Y，Kohsaka S，et al.Protein kinase C requirement in the activation of P38 mitogen-activated protein kinase，which is linked to the induction of tumor necrosis factor in lipopolysaccharide-stimulated microglia［J］.Neurochem Int，2004，44:205 －214.

［5］Wen YR，Tan PH，Cheng JK，et al.Microglia:a promising target for treating neuropathic and postoperative pain，and morphine tolerance［J］.J Formos Med Assoc，2011，110:487－494.

［6］Bennett GJ，Xie YK.A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man［J］.Pain，1988，33:87－107.

［7］Ji RR，Befort K，Brenner GJ，et al.ERK MAP kinase activation in superficial spinal cord neurons induces prodynorphin and NK-1 upregulation and contributes to persistent inflammatory pain hypersensitivity ［J］.J Neruosci，2002，22:478－485.

［8］Schafers M，Svensson CI，Sommer C，et al.Tumor necrosis factor-alpha induces mechanical allodynia after spinal nerve ligation by activation of P38 MAPK in primary sensory neurons［J］.J Neurosci，2003，23:2517 －2521.

［9］He XH，Zang Y，Chen X，et al.TNF-α contributes to upregulation of Nav1.3 and Nav1.8 in DRG neurons following motor fiber injury［J］.Pain，2010，151:266－279.

［10］Covey WC，Ignatowski TA，Renauld AE，et al.Expression of neuron-associated tumor necrosis factor alpha in the brain is increased during persistent pain［J］.Reg Anesth Pain Med，2002，27:357 －366.

［11］Ji RR，Gereau RWt，Malcangio M，et al.MAP kinase and pain［J］.Brain Res Rev，2009，60:135－148.

［12］Orhan CE，Onal A，Ulker S.Neurosci Lett.Antihyperalgesic and antiallodynic effect of sirolimus in neuropathic pain and the role of cytokines in this effect［J］.2010，481:17－20.