安瑩波，王漢斌，吳小紅，熊錫山，孫世惠，周育森

補體在百草枯急性中毒肺損傷中的作用研究

安瑩波，王漢斌，吳小紅，熊錫山，孫世惠，周育森

目的：研究補體在百草枯（PQ）急性中毒肺損傷中的作用。方法：采用20mg/kg PQ染毒小鼠，染毒后0 h、4 h、12 h、24 h、48 h檢測血清C3c水平、肺組織C3、C5a和C1q沉積和分布；選用PQ染毒劑10mg/kg、20mg/kg分別在染毒前48 h、36 h、24 h腹腔內(nèi)注射眼鏡蛇毒因子（CVF）2.5μg/200μl，染毒后48 h留取支氣管肺泡灌洗液（BALF）、肺組織，與未注射CVF以相同劑量染毒小鼠比較BALF總蛋白濃度、髓過氧化物酶（MPO）活性、組織病理以及存活率差異。結(jié)果：20mg/kg PQ染毒小鼠血清C3c水平在染毒后12 h升高，24 h達到高峰，持續(xù)至48 h；免疫組化顯示染毒后4 h C3在肺組織沉積，12 h開始C3沉積減少；C5a、C1q自染毒后4 h開始在肺組織沉積，且隨病程延長，著色逐漸加重；CVF阻斷補體后染毒小鼠肺組織損傷減輕，炎性細胞浸潤減少，且存活時間顯著延長。結(jié)論：在小鼠PQ中毒急性肺損傷早期，補體即被激活，并發(fā)揮重要作用，采用CVF進行補體抑制或阻斷，可以有效減輕組織病理損傷。

百草枯；急性肺損傷；補體；眼鏡蛇毒因子

R 996

百草枯（paraquat，PQ）是目前使用廣泛的有機雜環(huán)類除草劑，對人畜有很強的毒性，病死率高達51.7%[1]。PQ進入機體后，2 h血漿濃度達高峰，而肺內(nèi)濃度是血濃度的20～90倍，易導致肺損傷，多數(shù)中毒患者死于呼吸衰竭。目前PQ中毒導致急性肺損傷機制不完全清楚，大多數(shù)學者認為與氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生的毒性產(chǎn)物作用有關(guān)。近年來國內(nèi)外研究表明，在PQ中毒導致急性肺損傷的早期，有大量細胞因子，趨化因子參與[2]。PQ中毒導致肺損傷具有急性肺損傷（ALI）典型的臨床表現(xiàn)，其炎癥反應(yīng)表現(xiàn)為肺上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞膜受損，血管通透性增加，多形核白細胞浸潤。

多種因素導致的ALI，補體即被激活，補體激活產(chǎn)物（如C3a,C5a）是中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、單核巨噬細胞在肺內(nèi)聚集引起肺部炎癥損傷的重要趨化因子，并與許多細胞因子與趨化因子相互作用參與組織損傷[3]。本實驗通過建立小鼠PQ中毒導致急性肺損傷模型，研究血清C3c及補體成分C3、C5a和C1q在肺組織的表達。初步探討補體在PQ中毒導致急性肺損傷中的作用，為臨床干預(yù)治療提出新的思路，以便提供有效的防治措施。

1 材料及方法

1.1 材料上海先正達投資有限公司提供20%百草枯濃縮液；碧云天生物技術(shù)研究所提供Bradford蛋白濃度測定試劑盒；南京建成生物工程研究所提供髓過氧化物酶（MPO）檢測試劑盒；徐在海教授惠贈羊抗人補體C3抗體、金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）、過氧化物酶-抗過氧化物酶復(fù)合物（PAP）；思達生物醫(yī)學研究所提供大鼠抗小鼠抗補體1q抗體(C1q)；郭仁峰教授惠贈兔抗小鼠C5a多克隆抗體；北京中山生物有限公司提供生物素化兔抗大鼠IgG、生物素化山羊抗兔IgG、辣根酶標記鏈霉卵白素工作液、DAB顯色劑。

1.2 動物實驗分組BALB/c雌性小鼠，8～12周齡，清潔級，平均體重20 g，軍事醫(yī)學科學院動物中心提供。（1）選擇40只BALB/c雌性小鼠，隨機分為5組，每組8只。對照組0 h組，小鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.5ml。染毒組將PQ濃縮液按不同濃度以生理鹽水稀釋至0.5 ml后腹腔內(nèi)注射，以20 mg/kg PQ進行染毒，染毒后4 h、12 h、24 h、48 h組。（2）選擇72只BALB/c雌性小鼠，隨機分為8組。10mg/kg染毒組2組：P10-1組8只、P10-2組10只；20mg/kg染毒組2組：P20-1組8只、P20-2組10只。動物在PQ染毒前48 h、36 h、24 h腹腔內(nèi)注射眼鏡蛇毒因子（CVF）溶液2.5μg/200μl。CVF+10 mg/kg染毒組2組：C10-1組8只、C10-2組10只；CVF+20mg/kg染毒組2組：C20-1組8只、C20-2組10只。其中P10-2、C10-2、P20-2、C20-2，用以觀察存活率，其余小鼠染毒后48 h處死。

1.3 標本采集不同時間點給不同組小鼠腹腔內(nèi)注射0.5ml氯胺酮溶液深度麻醉后，打開胸腔直接用1ml注射器經(jīng)小鼠右心室取血；剪開氣管，用微量移液器抽取0.8ml生理鹽水，注入小鼠肺部，反復(fù)灌洗3次，回收支氣管肺泡灌洗液（BALF）；留取肺組織，分別用于病理學分析、髓過氧化物酶（MPO）活性測定、免疫組化檢測。

1.4 檢測方法MPO、Bradford蛋白檢測：嚴格按照MPO、Bradford蛋白濃度測定試劑盒規(guī)定對小部分肺組織及BALF實施操作。病理標本制備：部分肺組織經(jīng)4%中性甲醛固定后，按梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片（厚度5μm），蘇木素-伊紅染色（HE染色），觀察病理變化。C3c水平測定：小鼠右心室采血后室溫放置30 min，放入4℃冰箱1 h，離心4000 g×10min，分離血清，測定C3c水平。小鼠血清C3c水平以不同時間點的測定值與正常對照之間的比值來表示。補體免疫組化檢測：大部分肺組織放入盛有冷凍包埋劑（OCT）的凍存管中，經(jīng)-196℃液氮速凍后，6μm冰凍連續(xù)切片，常規(guī)方法進行補體成分的免疫組化檢測。取冰凍切片磷酸鹽緩沖液（TBS）浸洗5min×2次；滴加一抗，37℃孵育過夜；次日取出，室溫放置10min，TBS浸洗5min×3次；滴加二抗，37℃孵育30min，TBS浸洗5 min×3次；滴加PAP標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30min，TBS浸洗5min×3次；DAB顯色、蘇木素襯染、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。陽性結(jié)果為細支氣管上皮基底膜、血管內(nèi)皮及肺間質(zhì)棕褐染色。著色程度分為強陽性（＋＋）、陽性（＋）、弱陽性（±）及陰性（－），分別以3、2、1、0表示，進行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計學分析用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以（s）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異非常顯著。

2 結(jié)果

2.1 PQ 染毒小鼠血清C3c動態(tài)水平變化染毒后4 h血清C3c水平與正常相近；12 h升高明顯，到24 h達高峰，一直持續(xù)到48 h。12 h、24 h和48 h與 0 h組之間差異非常顯著（P＜0.01）。見表1。

2.2 染毒后不同時間點補體成分在肺內(nèi)表達與0 h對照組（圖1，A）相比，小鼠染毒后4 h補體C3在肺間質(zhì)、細支氣管上皮及血管內(nèi)皮表達最強（圖1，B），著色逐漸變淡。C5a在肺組織表達增強，染毒后24 h C5a在血管內(nèi)皮著色顯著（圖1，C），在肺間質(zhì)的表達48 h最明顯。C1q在染毒后4 h肺血管內(nèi)皮及間質(zhì)略有沉積，12 h肺血管內(nèi)皮著色顯著，48 h在肺間質(zhì)、細支氣管上皮基底膜和肺血管內(nèi)皮均有特異性著色，且最強（圖1，D）。見圖1。

圖1 小鼠肺組織補體成分免疫組化檢測（顯微鏡倍數(shù)×20）

2.3 補體抑制后染毒對小鼠中毒表現(xiàn)與存活率的情況染毒后第3天P10組部分小鼠出現(xiàn)皮毛疏松、活動度差，呼吸略顯急促，體重下降。隨病程延長，癥狀加重，存活率為20%；C10組小鼠無明顯中毒表現(xiàn)，且長期存活。P20組小鼠比P10組癥狀明顯加重，第3天P20-2組存活率為0；C20組小鼠中毒表現(xiàn)與P20組相似，但第3天C20組存活率為70%，第4天40%，到第5天為0?？梢娧a體耗竭后10mg/kg染毒小鼠可長期存活，20mg/kg染毒可以延長生存時間。見圖2。

表1 染毒后不同時間點各補體成分在肺內(nèi)表達情況（±s）

表1 染毒后不同時間點各補體成分在肺內(nèi)表達情況（±s）

注：染毒組與0 h組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表2 補體耗竭后PQ 染毒小鼠肺系數(shù)、BALF 總蛋白含量和肺組織MPO活性（±s)

表2 補體耗竭后PQ 染毒小鼠肺系數(shù)、BALF 總蛋白含量和肺組織MPO活性（±s)

注：C10-1與P10-1組、C20-1與P20-1組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

?

圖2 補體耗竭后PQ 染毒對小鼠存活率的影響

2.4 補體抑制對PQ 中毒小鼠肺系數(shù)、BALF總蛋白含量和肺組織MPO 活性的情況補體耗竭后即在無補體參與情況下，C10-1與P10-1組，C20-1與P20-1組肺系數(shù)、BALF總蛋白含量和肺組織MPO活性均有所下降，組間比較，差異顯著（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

2.5 補體抑制后染毒小鼠肺組織病理學觀察染毒后48 h P10-1組小鼠肺泡上皮細胞變性脫落，肺泡腔少量滲出液，血管周圍輕度組織水腫，支氣管上皮細胞輕度變性，炎細胞浸潤（圖3，A）；而C10-1組小鼠肺損傷明顯減輕，表現(xiàn)為肺泡上皮細胞基本完好，血管和支氣管上皮細胞正常，少量炎細胞浸潤（圖3，B）；P20-1組小鼠肺泡上皮細胞變性脫落，肺泡腔增大，滲出較多，血管周圍組織水腫，支氣管上皮變性，間隔明顯增寬，大量炎細胞浸潤（圖3，C）；C20-1組小鼠肺損傷程度較前者略輕，主要表現(xiàn)在肺泡內(nèi)腔滲出較少，血管、支氣管周圍及肺間質(zhì)炎細胞浸潤減少，肺間隔呈局灶性增寬（圖3，D）。見圖3。

3 討論

補體為機體非特異性免疫中的重要分子物質(zhì)，作為機體自我保護的第一道防線，是炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)機制。但補體過度激活可引起病理損傷。急性肺損傷發(fā)病早期，首先是補體系統(tǒng)被激活。補體活化通過經(jīng)典、旁路替代和凝集素三條主要途徑，都以C3活化作為樞紐。本實驗采用免疫組化檢測補體C3在肺組織的表達，小鼠染毒后4 h補體C3在肺間質(zhì)、細支氣管上皮及血管內(nèi)皮表達最強，著色逐漸變淡，到48 h則低于正常小鼠。已知C3轉(zhuǎn)化酶裂解C3，產(chǎn)生C3a和C3b，C3b半衰期很短（不到100μs），因子I裂解C3b形成iC3b和可溶性片段C3f，iC3b進一步分裂成C3dg附著于細胞膜，而釋放C3c[4]。本實驗檢測血清C3c水平發(fā)現(xiàn)，染毒后4 h血清C3c水平與正常相近；到12 h升高明顯，24 h達高峰，一直持續(xù)到48 h，C3c增多表明有補體的活化[5]。此結(jié)果與相關(guān)研究一致[6-7]，發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性創(chuàng)傷和膿毒血癥患者發(fā)生ALI早期表現(xiàn)為C3下降，C3被裂解、消耗，故裂解產(chǎn)物升高。C3裂解產(chǎn)物C3a雖然比C5a活性小10～100倍，其含量卻是C5a的20倍，它可以引起血管通透性增強、刺激粒細胞脫顆粒，并可引起杯狀細胞黏液分泌[8]。

圖3 CVF 耗竭補體染毒小鼠肺組織HE染色（顯微鏡倍數(shù)×20）

PQ染毒后C1q在肺間質(zhì)、細支氣管上皮基底膜及肺血管內(nèi)皮特異性著色逐漸增強。Mooly等[9]研究表明脂多糖誘發(fā)急性肺損傷時，C1q在發(fā)病4 h升高，到48 h開始下降。C1是補體系統(tǒng)經(jīng)典激活途徑的起始成分，C1q為具有識別作用的亞單位，在肺組織高表達，說明PQ中毒導致急性肺損傷可能有補體經(jīng)典途徑激活；C1q本身還可以與相應(yīng)的受體結(jié)合，吞噬細胞、粒細胞、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞等都可表達C1q-R；C1q可刺激中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等產(chǎn)生過氧化物，可能加重組織損傷[8]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，小鼠染毒后肺組織內(nèi)C5a表達增強。C5a作為補體激活產(chǎn)物，具有廣泛的生物活性，在急性肺損傷的發(fā)病中起著非常重要的作用。它是有效的髓系細胞激活劑，尤其是中性粒細胞表達很高的C5aR，趨化作用大大加強，多形核中性粒細胞在肺血管內(nèi)聚集，釋放氧自由基、蛋白溶解酶，導致肺毛細血管內(nèi)皮細胞、肺間質(zhì)及肺泡上皮細胞損傷，從而引起通透性肺水腫[10]。另外，中性粒細胞產(chǎn)生的氧自由基、蛋白水解酶、彈性蛋白酶、絲氨酸蛋白酶以及某些細胞因子（如IL-6）等可使C5轉(zhuǎn)化為C5a，引起組織損傷。非髓系細胞如細支氣管、肺上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞均表達C5aR，并與C5a發(fā)生反應(yīng)[11]。C5a對血管內(nèi)皮的作用包括產(chǎn)生炎癥因子（如IL-8家族和趨化因子等）和損傷產(chǎn)物（如組織因子有顯著的凝血酶原活性），可造成血管內(nèi)凝血[12]。

CVF作為旁路補體激活物，與B因子結(jié)合成CVFB復(fù)合物，在D因子作用下裂解為CVFBb復(fù)合物，類似于哺乳動物的補體轉(zhuǎn)化酶C3Bb，具有裂解補體C3和C5的作用。CVFBb較C3Bb穩(wěn)定，半衰期可達7 h，因此可更為持久地裂解C3、C5，直至最后耗竭[12]。本實驗給小鼠連續(xù)腹腔內(nèi)注射小劑量CVF后再PQ染毒，結(jié)果顯示肺系數(shù)、BALF總蛋白含量、肺組織MPO活性均有所下降，后兩者差異非常顯著（P＜0.01）。肺組織病理觀察C10、C20組小鼠肺組織損傷減輕，以C10組最為顯著。小鼠在沒有補體參與下染毒，肺組織中性粒細胞浸潤減少，肺血管通透性減輕，損傷減輕，存活時間延長，這說明補體在PQ中毒導致急性肺損傷中可能具有促進作用，抑制補體活性可以減輕肺組織損傷。

到目前為止，PQ中毒導致急性肺損傷發(fā)病機制尚未完全闡明。長期以來，大多數(shù)學者認為氧自由基是其中毒基礎(chǔ)，然而采取的一系列針對性治療措施均未能使死亡率有所下降，本實驗通過成功建立小鼠PQ中毒導致急性肺損傷模型，研究補體成分C3、C5a和C1q在中毒后肺組織中的表達情況，并對補體在急性肺損傷中的作用進行了初步探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)補體在PQ中毒小鼠導致急性肺損傷早期即被激活，并可能在肺損傷中發(fā)揮重要的促進作用。然而，PQ中毒導致急性肺損傷中補體如何被激活，通過哪條途徑激活及如何發(fā)揮致病作用，還需要深入研究。

[1]張錫剛，湯雪萍，李光，等.早期大劑量甲潑尼松龍聯(lián)合環(huán)孢素A沖擊治療對口服百草枯中毒患者預(yù)后的影響[J].解放軍醫(yī)學雜志，2007，32（12）：1296-1298.

[2]Cho JH，Yang DK，Kim L，et al.Inhaled nitric oxide improves the survival of the paraquat-injured rats[J].Vascul Pharmacol，2005，42（4）：171-178.

[3]Milan Basta，F(xiàn)redric Van Goor，Stefano Luccioli，et al.F（ab）2-mediated neutral ization of C3a and C5a anaphylatoxins：a novel ef fector function of immunoglobulins[J].Nature medicine，2003，9（4）：431-438.

[4]趙修竹，龔非力.補體學[M].武漢：湖北科學技術(shù)出版社，1998：16-70.

[5]李影林.中華醫(yī)學檢驗全書[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：2069-2081.

[6]St?ve S,Wel te T,Wagner TO,et al.Circulating complement proteins in patients with sepsis or systemic inf lammatory response syndrome[J]. Cl inical and Diagnostic Laboratory Immunology，1996，3（3）：175-183.

[7]Kang HJ,Bao L,Xu Y,et al.Increased serum C3 level in Cr ry t ransgenic mice par tial ly abrogates its complement inhibitory ef fects[J]. Cl in Exp Immunol，2004，136（2）：194-199.

[8]金伯泉.細胞和分子免疫學[M].北京：科學出版社，2001：240-276.

[9]Bolger MS,Ross DS,Jiang H,et al.Complement leveld and activity in the normal and LPS-injuried lung[J].Am J Physiol Lung Cel l Mol Physiol，2007，292（3）：L748-759.

[10]Whitehead GS,Grasman KA,Kimmel EC.Lung function and airway inf lammation in rats fol lowing exposure to combustion products of carbon-graphite/epoxy composite material：comparison to a rodent model of acute lung injury[J].Toxicology，2003，183（1-3）：175-197.

[11]Schmid RA，Zol linger A，Singer T，et al.Ef fect ofsoluble complement receptor type 1 on reper fusion edema and neutrophi l migration af ter lung al lot ransplantation in swine[J].J Thorac Cardiovasc Surg，1998，116（1）：90-97.

[12]Younger JG，Sasaki N，Delgado J，et al.Systemic and lung physiological changes in rats af ter int ravascular activation of complement[J].J Appl Physiol，2001，90（6）：2289-2295.

基金編號：國家自然科學基金（NSFC1071538,30972616）

100085北京，北京市海淀醫(yī)院急診科（安瑩波）；解放軍307醫(yī)院腎內(nèi)科（王漢斌，熊錫山）；軍事醫(yī)學科學院五所（吳小紅，孫世惠，周育森）

周育森，E-mai l：yszhou@nic.bmi.ac.cn

2012-08-06）