尋常型銀屑病皮損中磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3與白介素-17的表達(dá)及意義

盧井發(fā) 羅迪青

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)皮膚科，廣東 廣州 510700

銀屑病是多基因遺傳背景下免疫系統(tǒng)異常引起的疾病，目前的研究主要集中在免疫系統(tǒng)和角質(zhì)形成細(xì)胞方面。PStat3是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducers and activators of transcrip tion，Stat）家族中重要成員——信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3（Stat3）的活化形式，它通過酪激酶-Stat途徑廣泛參與細(xì)胞的存活、增殖、分化、凋亡、血管發(fā)生、轉(zhuǎn)移以及免疫調(diào)節(jié)等過程。Sano等[1]研究K5.Stat3 C銀屑病小鼠模型時(shí)，發(fā)現(xiàn)真皮上層和表皮層CD4+T細(xì)胞顯著增多，并提出Stat3是連接免疫細(xì)胞和活化的角質(zhì)形成細(xì)胞間的橋梁。Mathur等[2]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Stat3缺陷小鼠的IL-17表達(dá)減少，相反，過度持續(xù)表達(dá)的Stat3能增加IL-17表達(dá)。此外，Stat3可直接與IL-17啟動(dòng)子結(jié)合誘導(dǎo)IL-17表達(dá)。為進(jìn)一步研究銀屑病的發(fā)病機(jī)制，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)銀屑病皮損中P-Stat3和IL-17的表達(dá)，并分析兩者之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)組皮膚組織取自于2009年1月～2010年4月中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科及黃埔院區(qū)皮膚科就診患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：臨床及病理均符合銀屑病診斷，2個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)用藥及1個(gè)月內(nèi)未外用藥物，不伴類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腫瘤、肝腎功能損傷等其他嚴(yán)重疾病以及妊娠、哺乳期婦女。共23例，其中，男16例，女7例；年齡3～60歲，中位年齡31歲；病程1周～13年。并根據(jù)皮損面積及嚴(yán)重程度評(píng)分（psoriasis area and severity index，PASI）標(biāo)準(zhǔn)[3]記錄患者PASI分值。14例正常對(duì)照皮膚組織取自于我院整形外科。研究符合并通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（中山一院論審[2009]110），檢查前簽訂患者知情同意書。

1.2 試劑

一抗：兔抗人單克隆抗體 Phospho-Stat3（Tyr705）購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；鼠抗人IL-17單克隆抗體購(gòu)自于Satacrutz公司；即用型SP試劑盒購(gòu)自于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

采用免疫組化ABC法，嚴(yán)格按照說明書操作，IL-17一抗（1∶100）和 P-Stat3 一抗（1∶50），用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷

P-Stat3：參照文獻(xiàn)[4]，采用半定量計(jì)算判斷陽性表達(dá)結(jié)果：陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～75%為2分，>75%為3分；陽性強(qiáng)度呈淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分，兩項(xiàng)相乘為強(qiáng)度積分。IL-17：以真皮層血管為中心，在400倍鏡下取5個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。分別由兩人獨(dú)立閱片，差別較大者，取協(xié)商的結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。銀屑病皮損及正常對(duì)照組的P-Stat3和IL-17的比較用兩樣本比較的Mannwhitney U秩和檢驗(yàn)，兩者間的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析，兩者與PASI評(píng)分間的關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)性分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

銀屑病皮損的PASI評(píng)分為2.0～45.3分，中位數(shù)為8.4分。

皮膚中P-Stat3、IL-17的表達(dá)：尋常型銀屑病皮損與正常對(duì)照皮膚組織中均有P-Stat3表達(dá)（圖1、2），尋常型銀屑病皮損P-Stat3陽性表達(dá)主要位于表皮棘細(xì)胞層的胞核中，少數(shù)位于顆粒層和基底細(xì)胞層（圖1），正常對(duì)照組主要位于基底細(xì)胞層的細(xì)胞核中（圖2），銀屑病皮損IL-17陽性表達(dá)主要位于真皮淺層淋巴細(xì)胞胞漿中（圖3），而正常對(duì)照組皮膚組織中無IL-17的表達(dá)（圖4）。

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組皮損中P-Stat3、IL-17水平升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-5.043、-4.324，均 P<0.01）。實(shí)驗(yàn)組皮損中P-Stat3、IL-17水平與PASI呈正相關(guān)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（rs=0.713、0.797，均P<0.001）。而皮損中PStat3與IL-17呈正相關(guān)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（rs=0.762，P<0.001）。 見表 1。

表1 尋常型銀屑病皮損與正常對(duì)照皮膚中磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3與白介素-17的比較

3 討論

3.1 尋常型銀屑病皮損中P-Stat3的表達(dá)

P-Stat3是Stat3的活化形式，可以識(shí)別并結(jié)合靶基因DNA特異的反應(yīng)元件，誘導(dǎo)抗凋亡基因如Bcl-xl、Bcl-2、Mcl-1和細(xì)胞周期調(diào)控基因如c-Myc、cyclinD1及內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等的表達(dá)[5-6]，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤、自身免疫性疾病等多種疾病相關(guān)。國(guó)內(nèi)研究證實(shí)銀屑病皮損中P-Stat3增多，陽性表達(dá)主要位于棘細(xì)胞層和顆粒層細(xì)胞的胞核中[7-9]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)尋常型銀屑病皮損中P-Stat3表達(dá)增多且與PASI評(píng)分呈正相關(guān)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)相符合，進(jìn)一步證實(shí)P-Stat3與銀屑病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。此外，筆者發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組P-Stat3陽性表達(dá)主要位于棘細(xì)胞層的胞核中，少數(shù)位于顆粒層和基底細(xì)胞層，對(duì)照組P-Stat3陽性表達(dá)主要位于基底細(xì)胞層的胞核中，實(shí)驗(yàn)組P-Stat3表達(dá)部位較正常對(duì)照上移，其具體原因尚不清楚；是否與銀屑病皮損中表皮細(xì)胞增生周期縮短、細(xì)胞由基底細(xì)胞層較快移行到棘細(xì)胞及顆粒細(xì)胞有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

3.2 尋常型銀屑病皮損中IL-17的表達(dá)

IL-17主要由Th17細(xì)胞分泌，是Th17細(xì)胞的標(biāo)志細(xì)胞因子，主要生物學(xué)作用是促炎癥反應(yīng)，可正調(diào)節(jié)一些細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶，引起中性粒細(xì)胞向炎癥區(qū)域募集[10]。IL-17與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、哮喘等免疫介導(dǎo)的疾病相關(guān)，國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)銀屑病患者血液及皮損中IL-17水平增多，并與銀屑病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[11-13]。銀屑病皮損中IL-17A mRNA水平升高，且與皮損內(nèi)IL-23R mRNA水平以及PASI評(píng)分呈線性正相關(guān)[14]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損真皮層IL-17表達(dá)增加，陽性表達(dá)主要位于真皮淺層，且IL-17水平與銀屑病嚴(yán)重程度的PASI評(píng)分呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)IL-17在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中起主要作用。

圖1 尋常型銀屑病皮損處磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3表達(dá)

圖2 正常對(duì)照皮膚中磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3表達(dá)

圖3 尋常型銀屑病皮損處白介素-17表達(dá)

圖4 正常對(duì)照皮膚中白介素-17表達(dá)

3.3 尋常型銀屑病皮損中P-Stat3與IL-17的關(guān)系

RORγt和RORα是原始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞早期轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵性細(xì)胞因子。在銀屑病皮損中，Th17細(xì)胞主要分泌IL-6、IL-17、IL-23等細(xì)胞因子。有研究發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-21和IL-23等可誘導(dǎo)Stat3磷酸化形成P-Stat3，P-Stat3可與IL-17mRNA的啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)IL-17mRNA基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)RORγt和RORα的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)IL-17的水平[10,15]。研究還發(fā)現(xiàn)Stat3的缺乏可使原始T細(xì)胞不能表達(dá)RORγt，從而減少原始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化[16]。此外，P-Stat3可促進(jìn)IL-23R的表達(dá)，IL-23作用于IL-23R，誘導(dǎo)RORγt表達(dá)，形成成熟Th17細(xì)胞[17-20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)尋常型銀屑病皮損中P-Stat3和IL-17表達(dá)呈正相關(guān)，且與銀屑病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示P-Stat3和IL-17在銀屑病發(fā)病機(jī)制中起重要作用，但PStat3與IL-17的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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