李梅云

（云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 玉溪 653100）

煙草黑脛病是煙草（Nicotiana tabacumL.）生產(chǎn)上的毀滅性病害之一，是制約我國(guó)各煙區(qū)煙葉生產(chǎn)的最重要因素[1-3]。經(jīng)驗(yàn)證明，以抗病品種為中心的綜合防治，能有效控制煙草黑脛病的為害[4]。在實(shí)施綜合防治計(jì)劃中，應(yīng)注意的重要問(wèn)題之一就是煙草黑脛病菌的變異性。在煙草的生產(chǎn)過(guò)程中，新的高毒力菌系或新的生理小種的出現(xiàn)，往往使一批抗病品種“喪失”抗病性而成為感病品種，造成病害大流行。研究煙草黑脛病菌生理小種的變化和組成及其與寄主抗性間的關(guān)系，對(duì)煙草抗黑脛病育種工作極為重要。為此，筆者所在課題組于 2004—2005年從云南各主要產(chǎn)煙州、市分離純化84株黑脛病菌，進(jìn)行了致病性測(cè)定，2006—2008年對(duì) 55個(gè)地方代表菌株進(jìn)行生理小種鑒別。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

試驗(yàn)于2004—2008年在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院研和試驗(yàn)基地溫室與實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 供試菌株與品種 所有菌株均采自云南各主要產(chǎn)煙地州，于2004—2005年間先后分離純化。鑒別寄主包括 N.plumbaginifolia、N.nudicaulis、NC1071、L8，抗病對(duì)照品種K326和感病對(duì)照品種小黃金1025。

1.2.2 培養(yǎng)基與試劑 燕麥液體培養(yǎng)基用于搖床加富培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基用于菌株活化與培養(yǎng)，加0.05 g/mL氯霉素用于病原的分離與純化。

蔗糖-檸檬酸-維生素-無(wú)機(jī)鹽（SCBM）液體培養(yǎng)基[3]：蒸餾水1000 mL、蔗糖30 g、檸檬酸20 g、氯化鈣1.0 g、硝酸鉀2.0 g、磷酸二氫鉀0.67 g、磷酸氫二鉀0.33 g、1%三氯化鐵10滴、VB1 1 mg。TTC液體培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)基中加入0.05%TTC；TTC固體培養(yǎng)基為燕麥瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)加入0.05%TTC。

1%糖標(biāo)準(zhǔn)混合溶液：取果糖、葡萄糖、蔗糖各1 g，混合后75%酒精溶解定容至100 mL。苯胺-二苯胺-磷酸顯色劑：1 g二苯胺溶于1 mL苯胺、5 mL 85%磷酸、50 mL丙酮組成的混合溶液中。漂白粉濾液：稱(chēng)取10 g漂白粉溶于140 mL水中，過(guò)濾?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 致病性測(cè)定 供試菌種燕麥瓊脂培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)7 d。煙苗移栽前2周，挑取菌絲體接種培養(yǎng)液，120 r/min、28 ℃搖床培養(yǎng)2周，驟然降溫，制成游動(dòng)孢子懸浮液。調(diào)節(jié)游動(dòng)孢子懸浮液濃度 108CFU/mL，備用。

供試品種漂浮育苗，待煙苗長(zhǎng)到6～8葉期移栽到塑料花盆（Φ16 cm）中，緩苗生長(zhǎng)10 d。

菌株孢子懸浮液灌根接種紅花大金元 10葉期左右大小煙株。具體方法：在煙苗莖基部劃一傷口，游動(dòng)孢子懸浮液灌根接種于傷口處，脫脂棉保濕。每株15 mL，每菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)15株，設(shè)清水對(duì)照，接種3 d后開(kāi)始進(jìn)行調(diào)查，按照嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)，計(jì)算發(fā)病率與病情指數(shù)[5]。

1.3.2 溫室中生理小種的鑒定 從致病性測(cè)定試驗(yàn)中挑選出強(qiáng)致病力菌株、中致病力菌株、弱致病力菌株3個(gè)菌系共55個(gè)代表菌株進(jìn)行生理小種鑒定。將供試菌株的游動(dòng)孢子懸浮液分別接種6個(gè)供試品種煙苗。每菌株設(shè)3次重復(fù)，另設(shè)清水對(duì)照，3 d后開(kāi)始進(jìn)行病害分級(jí)調(diào)查，計(jì)算病情指數(shù)并根據(jù)抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)。結(jié)合前人煙草黑脛病菌0、1、2和3號(hào)小種的寄主反應(yīng)[3,7-11]判斷生理小種類(lèi)型（表1）。

表1 煙草黑脛病菌0、1、2和3號(hào)小種的寄主反應(yīng)Table 1 Host reaction of Phytophthora parasitica var.nicotianae race 0, 1, 2 and 3

1.3.3 生理生化鑒定 根據(jù)溫室生理小種鑒定結(jié)果，從中取代表菌株 18個(gè)，包括各種抗感病反應(yīng)類(lèi)型，分別用三氯苯基四唑氮（TTC）法與硅膠層析法對(duì)煙草黑脛病菌菌株所屬生理小種進(jìn)行鑒別。

供試菌株在 TTC固體培養(yǎng)基平板上的顏色變化：TTC法測(cè)定的病菌在SCBM固體（pH 5.5）培養(yǎng)基28 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基分別加TTC（0.05%，w/v）和不加2種處理，定期觀察菌落生長(zhǎng)和顏色反應(yīng)。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，以不加TTC的燕麥瓊脂培養(yǎng)基為對(duì)照，觀察顏色反應(yīng)。

硅膠G層析分析各菌株中的糖分：用于硅膠層析的菌懸液來(lái)自SCBM液體培養(yǎng)。取培養(yǎng)9 d的菌懸液準(zhǔn)備病菌菌株層析樣品時(shí)，菌懸液先用紗布過(guò)濾，去掉菌絲體，液體部分離心（700 rpm，10 min）沉淀剩余菌體，上清液作為層析樣本使用。沒(méi)有培養(yǎng)過(guò)病菌的培養(yǎng)基原液同樣離心，上清液用作對(duì)照。用移液器吸取樣品1.5 μL點(diǎn)樣，吹干。將一端放入盛有展層溶劑的層析缸中，當(dāng)展層溶劑到達(dá)距薄析頂端約1 cm處時(shí)取出薄板，60 ℃烘箱烘干，顯色。標(biāo)注液為 1%的蔗糖、葡萄糖和果糖混合溶液，展層劑溶液含正丁醇、冰醋酸、乙醚和水(9:6:3:1)，顯色劑為苯胺－二苯胺－磷酸顯色劑。層析完成后計(jì)算 Rf值，公式為 Rf＝h/H，其中，h為原點(diǎn)到色斑中心距離，H為原點(diǎn)到展層劑前沿的距離。

2 結(jié) 果

2.1 致病性

2004年分離的 39株煙草黑脛病菌致病率22.22%～100%，平均發(fā)病率93.73%，未接種植株沒(méi)有發(fā)病。病指 2.8～25.0有 17株，占總菌株數(shù)的43.59%；病指 25.1～60.0有 10株，占 25.64%；病指60.1～100.0有12株，占30.77%。2005年分離的45個(gè)菌株致病率在 66.67%～100%，平均發(fā)病率為96.05%，未接種植株沒(méi)有發(fā)病。病指16.7～25.0有7株，占15.56%；病指25.1～60.0有10株，占22.22%；病指60.1～80.0有20株，占44.44%；病指80.1～100.0有8株，占17.78%。

2.2 生理小種的初步鑒定

對(duì)照煙草黑脛病菌0、1、2和3號(hào)小種的寄主反應(yīng)（表2），供試55個(gè)菌株中，第1種反應(yīng)類(lèi)型33個(gè)菌株可確定為0號(hào)生理小種，第2種反應(yīng)類(lèi)型9個(gè)菌株和第3種反應(yīng)類(lèi)型8個(gè)菌株對(duì)NC1071、N.nudicaulis和N.plumbaginifolia抗病，但由于L8品種的葉對(duì)0號(hào)生理小種感病，根據(jù)寄主對(duì)病菌的抗性，可以判斷這17個(gè)菌株為0號(hào)或3號(hào)生理小種，究竟是0號(hào)還是3號(hào)小種可通過(guò)生理生化方法判斷。剩余的5個(gè)菌株中51～54號(hào)4個(gè)菌株對(duì)L8表現(xiàn)抗病，說(shuō)明它們不是1或3號(hào)生理小種，28#菌株對(duì)L8與NC1071表現(xiàn)中感，對(duì)N.nudicaulis和N.plumbaginifolia表現(xiàn)抗病，究竟是屬于新的分化類(lèi)型還是由于它們的致病力懸殊引起的，需進(jìn)一步鑒定。

表2 各分離菌株生理小種的初步鑒定Table 2 Preliminary race indentification of Phytophthora parasitica var.nicotianae

2.3 生理生化鑒定

2.3.1 供試分離物在 TTC固體培養(yǎng)基平板上的顏色變化 18個(gè)菌株在TTC固體培養(yǎng)基中均產(chǎn)生變色反應(yīng)（圖1、表3）。各分離物在TTC固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，先移入的菌塊呈紅色，繼而伸入基質(zhì)的菌絲變色，自培養(yǎng)皿背面觀察菌落擴(kuò)展呈放射狀，外緣菌絲顏色稍淺，氣生菌絲均為白色絮狀。顯微鏡下觀察與一般菌絲相似，無(wú)顏色變化及生長(zhǎng)差異。生長(zhǎng)120 h后，05P47、05P66、28#三個(gè)分離物的菌絲顏色較淺，05P22、05P33、05P35、05P59、26#、62803分離物的菌絲顏色稍淺，但這些分離物的氣生菌絲都茂盛，這可能與分離物在燕麥瓊脂培養(yǎng)基上的代謝特點(diǎn)有關(guān)。

圖1 分離物在TTC培養(yǎng)基的變色反應(yīng)Fig.1 Color change of Phytophthora parasitica var.nicotianae (Ppn) strains

在燕麥+TTC固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，煙草黑脛病菌0號(hào)和1號(hào)小種產(chǎn)生脫氫酶，該酶作用于TTC產(chǎn)生紅色脂溶性化合物（圖1），另外兩個(gè)小種不產(chǎn)生脫氫酶，用含 TTC培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)不顯紅色[12]。根據(jù)培養(yǎng)基的顯色反應(yīng)區(qū)別煙草黑脛病菌小種時(shí)，通常觀察到72 h即做出能否顯色的判斷。根據(jù)培養(yǎng)物引起“燕麥+TTC”固體培養(yǎng)基顏色變化的情況，18個(gè)待測(cè)菌株均顯示0號(hào)和1號(hào)小種的特征。

2.3.2 硅膠 G層析分析各分離物培養(yǎng)濾液中的糖分 硅膠層析是鑒定煙草黑脛病菌生理小種的重要方法，通過(guò)檢測(cè)病菌利用碳水化合物的代謝產(chǎn)物，幫助判斷小種歸屬。硅膠層析試驗(yàn)通常使用標(biāo)準(zhǔn)的糖溶液，與待測(cè)樣本同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)層析帶型和用作標(biāo)準(zhǔn)的糖類(lèi)在層析板上的遷移率（Rf），通過(guò)比較，確認(rèn)待測(cè)樣本所含糖的種類(lèi)。對(duì)照表4對(duì)比各色斑顏色和Rf值大小證實(shí)A為葡萄糖、B為果糖、C及原液CK為蔗糖。D色斑的Rf值最小且與其他值有明顯差異，其色斑顏色也與標(biāo)準(zhǔn)樣的任何一種不相同，據(jù)John L.Mcintyre的報(bào)道應(yīng)為蔗果三糖。據(jù)報(bào)道只有黑脛病菌0號(hào)和1號(hào)小種經(jīng)代謝能產(chǎn)生蔗果三糖，3號(hào)小種不能產(chǎn)生。我們?cè)噲D用這個(gè)方法鑒別云南菌株是0號(hào)還是1號(hào)小種，結(jié)果表明，18個(gè)待測(cè)菌株均能產(chǎn)生蔗果三糖，仍然只能歸為0號(hào)或1號(hào)小種（圖2，表4）。無(wú)論是層析帶型還是Rf值的相對(duì)大小，都表明來(lái)自云南的18個(gè)菌株即符合0號(hào)小種的特征，也符合1號(hào)生理小種的特征，與TTC培養(yǎng)基鑒別結(jié)果一致。

表3 各分離物在TTC固體培養(yǎng)基隨時(shí)間的顏色變化Table 3 Color change with time after incubating Ppn on TTC medium

3 討 論

圖2 各供試菌株硅膠G層析后現(xiàn)色結(jié)果Fig.2 Thin-layer silica gel chromatography on glass plates was used to visualize products

表4 層析板色斑Rf值比較Table 4 Rates (Rf values) of sugar flow during thin-layer silica gel chromatograph

依據(jù)鑒別寄主的反應(yīng)，1～33號(hào)菌株鑒定結(jié)果為0號(hào)生理小種；34～50號(hào)菌株依據(jù)鑒別寄主的反應(yīng)，為0號(hào)或3號(hào)生理小種，TTC培養(yǎng)基、硅膠G薄層層析的鑒定結(jié)果否定了它們?yōu)?3號(hào)生理小種的可能，說(shuō)明L8表現(xiàn)中感或感病是因?yàn)長(zhǎng)8葉片的特殊反應(yīng)引起的，由此確定34～50號(hào)菌株為0號(hào)生理小種；51～54號(hào)4個(gè)菌株對(duì)L8表現(xiàn)抗病，說(shuō)明它們不是1或3號(hào)生理小種，它們對(duì)NC1071、N.nudicaulis和N.plumbaginifolia中的2個(gè)鑒別寄主表現(xiàn)抗病，對(duì)另外1個(gè)鑒別寄主表現(xiàn)中度感病，也不完全符合0、2號(hào)生理小種的判斷；28#菌株對(duì)L8與NC1071表現(xiàn)中感，對(duì)N.nudicaulis和N.plumbaginifolia表現(xiàn)抗病，所以不是1號(hào)生理小種，根據(jù)TTC培養(yǎng)基與硅膠層析鑒定結(jié)果，應(yīng)為0號(hào)或1號(hào)生理小種，51～55號(hào)菌株究竟是不是0號(hào)生理小種還是屬于新的分化類(lèi)型，還是由于他們的致病力懸殊引起的，需要進(jìn)一步深入研究。根據(jù)以上研究結(jié)果，供試55個(gè)煙草黑脛病菌中有50個(gè)菌株為0號(hào)生理小種，占供試菌系的90.91%，由此說(shuō)明云南省煙草黑脛病菌優(yōu)勢(shì)菌為0號(hào)生理小種，在本次鑒定的供試菌株中未發(fā)現(xiàn)1、2、3號(hào)生理小種。

黑脛病菌0號(hào)、1號(hào)小種可以使TTC培養(yǎng)基變色，其基本機(jī)制是脫氫酶與TTC發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成有色物。至于TTC與脫氫酶作用的具體機(jī)制，染色深淺與TTC含量、培養(yǎng)基成分有無(wú)直接或間接關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。黑脛病菌能分泌水解酶，將蔗糖水解為果糖、葡萄糖而被同化，蔗果三糖由兩個(gè)果糖和一個(gè)葡萄糖組成。至于該復(fù)合物究竟在生化反應(yīng)過(guò)程中的哪一個(gè)步驟產(chǎn)生有待進(jìn)一步研究。

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