賀 勇,陳 嵌,唐治貴,劉容海,唐 佳,高中燕,米永華,袁作為
(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院檢驗科 402160;2.重慶市南川區(qū)人民醫(yī)院檢驗科 408400)
臨床生化檢驗工作中,經(jīng)常遇到被測項目的活力或濃度較高,超出測量線性范圍,需稀釋后再測。不同的方法、不同的測定項目以及不同的儀器對標(biāo)本稀釋液有不同的要求,不同稀釋液在不同的檢測系統(tǒng)中也會給測定結(jié)果帶來不同的影響[1]。目前全自動生化儀器均沒有配專用稀釋液,選用何種稀釋液既方便易得又不影響結(jié)果的準(zhǔn)確性,各實驗室的做法不盡相同,也缺乏系統(tǒng)評價[2-4]。近年來,干化學(xué)檢測方法逐步推廣,尤其在急診和門診中應(yīng)用廣泛,雖然部分廠家可以提供專用稀釋液,但在實際臨床工作中很少使用,也未見系統(tǒng)評價的報道。另一方面,由于干、濕2個檢測系統(tǒng)的檢測原理完全不同,相同稀釋液在不同的系統(tǒng)中是否一致,目前也未見報道[5-6]。本實驗擬用不同稀釋液對腎功能3項——尿素 (Urea)、肌酐(Cr)、尿酸(UA),分別在干、濕2個檢測系統(tǒng)上的檢測結(jié)果進(jìn)行評價與比較,以期找到與系統(tǒng)和項目相適應(yīng)的理想稀釋液。
1.1 材料
1.1.1 高值標(biāo)本 收集本院患者新鮮血清,無明顯溶血及肉眼可見的黃疸和脂血。其值均接近但未超出該項目的線性范圍上限。
1.1.2 稀釋液 蒸餾水(DH2O)為本實驗室自制,阻抗值大于1.5MΩ;生理鹽水(NS)注射液為四川科倫藥業(yè)公司生產(chǎn);7%小牛血清(7%BSA)用0.01mmol/L 磷酸緩沖夜(PBS)配制;混合血清均取自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院體檢人員新鮮血清,無明顯溶血、肉眼可見黃疸和脂血,其測定值均在參考區(qū)間內(nèi),收集混勻離心,取上清備用。
1.1.3 儀器 美國強生Vitros350干化學(xué)全自動生化分析儀,日本日立7600-020全自動生化分析儀。
1.1.4 試劑 美國強生干化學(xué)檢測系統(tǒng)采用配套試劑,日立7600-020檢測系統(tǒng)采用四川邁克公司試劑。
1.2 方法 分別在強生干化學(xué)系統(tǒng)(簡稱干系統(tǒng))和日立7600-020濕化學(xué)系統(tǒng)(簡稱濕系統(tǒng))測定高值標(biāo)本和混合血清的 Urea、Cr和 UA原始值(Ap),將標(biāo)本用 DH2O、NS、BSA、混合血清4種稀釋液分別進(jìn)行1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32共5個系列的倍比稀釋。在干、濕系統(tǒng)上分別對各稀釋樣品進(jìn)行檢測,然后將實際測定結(jié)果(A1)與通過計算得到的理論值(T)進(jìn)行偏差計算及相關(guān)性分析。
1.3 數(shù)據(jù)處理 在計算稀釋后標(biāo)本的理論值時,需考慮稀釋液的本底值(A0),本底值為稀釋液測定3次后的均值。稀釋后標(biāo)本的理論值計算公式如下:
相關(guān)性分析:以同一項目各稀釋系列的理論值為X,測定值為Y,擬合回歸方程。以r≥0.975作為相關(guān)性良好的判斷標(biāo)準(zhǔn)。所有數(shù)據(jù)分析均在Excel軟件上完成。
2.1 在儀器檢測范圍內(nèi),分別在干、濕系統(tǒng)上測得DH2O、NS、7%BSA、混合血清的本底值見表1。
表1 稀釋液中Urea、Cr、UA的本底值
表2 在干、濕檢測系統(tǒng)上,各稀釋液的回歸方程及相關(guān)系數(shù)
圖1 各稀釋液在干、濕化學(xué)系統(tǒng)Urea測定中的偏差比較圖
2.2 4種稀釋液在干、濕系統(tǒng)中不同項目檢測結(jié)果的偏差比較見圖1~3。
2.2.1 以美國CLIA′88總允許誤差的二分之一為判斷標(biāo)準(zhǔn),Urea、Cr、UA偏差可接受范圍分別為:±4.5%、±7.5%、±8.5%。從圖1中可見,在濕系統(tǒng)中,Urea用NS、BSA、混合血清稀釋均符合要求,而用DH2O在較高稀釋倍數(shù)(>1∶16)時不符合要求。在干系統(tǒng)中,Urea用NS和BSA稀釋超出了可接受范圍,DH2O和混合血清均符合要求,尤以混合血清稀釋偏差值最小。本實驗還發(fā)現(xiàn)Urea用NS和7%BSA稀釋后,在干、濕檢測系統(tǒng)中的偏差結(jié)果差異較大。
2.2.2 從圖2可見,濕化學(xué)系統(tǒng)中,Cr用DH2O、BSA、混合血清稀釋,測定結(jié)果均符合要求,而用NS稀釋,在較高稀釋倍數(shù)時就不符合要求。在干化學(xué)系統(tǒng)中,Cr除了BSA以外,各稀釋液均符合要求。從圖3可見在濕化學(xué)系統(tǒng)中,UA用DH2O、BSA、混合血清稀釋均符合要求,尤以混合血清稀釋,其測定結(jié)果偏差最小。在較高稀釋倍數(shù)時,用NS稀釋不符合要求。在干化學(xué)檢測系統(tǒng)中,在較高稀釋倍數(shù)(≥1∶16)時,UA用NS和BSA稀釋超出了可接受范圍,用DH2O和混合血清稀釋均符合要求,尤以混合血清稀釋,測定偏差最小。
圖2 各稀釋液在干、濕化學(xué)系統(tǒng)Cr測定中偏差比較圖
2.3 相關(guān)性分析 Urea、Cr及UA用不同的稀釋液進(jìn)行系列稀釋檢測后,分別對理論值與實測值進(jìn)行相關(guān)性分析,以實測值為Y,理論值為X擬合回歸方程,Y=b+a X。其回歸方程和相關(guān)系數(shù)平方見表2。
圖3 各稀釋液在干、濕化學(xué)系統(tǒng)UA測定中的偏差比較圖
在臨床常規(guī)生化檢測中,經(jīng)常會遇到超出檢測系統(tǒng)線性范圍的標(biāo)本,需要稀釋后復(fù)測,但究竟選用何種稀釋液,目前各實驗室做法并不相同[8-9]。同時干、濕系統(tǒng)檢測原理不同,干化學(xué)的理論基礎(chǔ)是Kubelka-Munk理論[10],濕化學(xué)的理論基礎(chǔ)是Lamber-Beer定律,它們在檢測相同項目能否選用同一種稀釋液還有待證明[11]。
本次實驗選取用腎功能3項檢查的高值標(biāo)本以4種稀釋液稀釋后檢測發(fā)現(xiàn),在濕化學(xué)檢測系統(tǒng)上,Urea用NS、BSA及混合血清均符合要求,而用DH2O稀釋在較高稀釋倍數(shù)(>1∶16)時不符合要求,可能是DH2O對介質(zhì)影響較大,故測定偏差也較大。對Cr、UA用DH2O、BSA、混合血清均符合要求,而用NS在較高稀釋倍數(shù)時不符合要求,可能是因為NS的離子強度、pH值與低值血清相近,但無蛋白質(zhì)和血清成分,故測定結(jié)果偏差大。
在干化學(xué)檢測系統(tǒng)上,Urea、UA用DH2O和混合血清稀釋均符合要求,Cr除了BSA以外各稀釋液均符合要求。對于腎功能3項檢查的高值標(biāo)本,在濕化學(xué)系統(tǒng)中,均可用BSA和混合血清進(jìn)行稀釋;在干化學(xué)系統(tǒng)中,均可用DH2O和混合血清進(jìn)行稀釋。而同時能應(yīng)用于干、濕檢測系統(tǒng)的稀釋液只有正常人混合血清。可能因為低值血清的蛋白質(zhì)、離子強度、pH值和其他血清成分基本相近,因此其測定結(jié)果偏差最小[12]。
值得一提的是,在美國強生Vitros350干化學(xué)全自動生化分析儀Urea的試劑說明書上,寫明了如果標(biāo)本中尿素濃度超出系統(tǒng)的可報告范圍,可以用VITROS 7%牛血清清蛋白溶液稀釋樣本[13]。而在本實驗中Urea用7%BSA稀釋,其結(jié)果超出了可接受范圍。造成這種矛盾的原因,有待進(jìn)一步研究。
在線性驗證實驗中,根據(jù)分析測量范圍(AMR)評價要求(a=1.00±0.05,r≥0.975或者r2≥0.95)[14-15],在濕化學(xué)檢測系統(tǒng)中,Urea、Cr及UA,用4種稀釋液稀釋后AMR評價均符合要求,表明腎功能3項指標(biāo)在濕化學(xué)系統(tǒng)中檢測值與理論值相關(guān)性良好,符合臨床檢驗的要求。而在干化學(xué)檢測系統(tǒng)中,Urea以DH2O或混合血清稀釋后,AMR評價符合要求,而以NS或BSA均不符合要求;Cr只有NS和混合血清稀釋后,AMR評價符合要求,而DH2O和BSA均不符合要求;UA用4種稀釋液稀釋后AMR評價均符合要求,BSA稀釋液在Urea、Cr的檢測中均不符合要求,可能與BSA影響了參加反應(yīng)的酶的活性有關(guān)。
由偏差分析和線性評價可以看出,在濕化學(xué)檢測系統(tǒng)上,即使4種稀釋液均符合AMR評價要求,但是偏差分析仍有差異,應(yīng)引起重視。提示需同時進(jìn)行偏差分析和線性評價,才能得出科學(xué)的結(jié)論。
日常工作中,不同的檢測系統(tǒng)都會遇到樣本的結(jié)果超過檢測項目的線性范圍。本研究發(fā)現(xiàn),在腎功能常規(guī)3項檢查超限時,同時能應(yīng)用于干、濕檢測系統(tǒng)的稀釋液只有健康人混合血清,它是比較理想的稀釋液,建議實驗室可以建立自己的混合血清標(biāo)本庫,以便用于常規(guī)生化檢測項目超限標(biāo)本的稀釋。
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