酪氨酸酚裂解酶及其在L－酪氨酸酶法合成中的應(yīng)用

韋平和，彭加平，營 佳

(常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 江蘇省應(yīng)用酶工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇 常州 213164)

酪氨酸酚裂解酶及其在L－酪氨酸酶法合成中的應(yīng)用

韋平和，彭加平，營 佳

(常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 江蘇省應(yīng)用酶工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇 常州 213164)

L－酪氨酸是目前仍采用酸水解法生產(chǎn)的少數(shù)氨基酸之一，應(yīng)用酶法取代水解法生產(chǎn)L－酪氨酸是近年來氨基酸工業(yè)的研究熱點(diǎn)之一。本文對酪氨酸酚裂解酶的結(jié)構(gòu)、機(jī)制及應(yīng)用進(jìn)行了綜述，為酶法生產(chǎn)L－酪氨酸及其衍生物提供參考。

酪氨酸酚裂解酶;L－酪氨酸;合成;結(jié)構(gòu);機(jī)制

酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol－lyase，TPL，EC 4.1.99.2)，也稱β－酪氨酸酶，在生物體內(nèi)催化L－酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物體外可將苯酚、丙酮酸和氨轉(zhuǎn)化為L－酪氨酸［1］，而L－酪氨酸常作為營養(yǎng)增補(bǔ)劑、苯丙酮尿癥患者的必需氨基酸，以及L－多巴、黑色素、對羥基肉桂酸、對羥基苯乙烯等醫(yī)藥化工產(chǎn)品的制備原料。該酶主要分布于腸細(xì)菌內(nèi)，也存在于一些嗜熱菌和節(jié)肢動物體中，其中酶活較高的微生物主要是草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)、中間檸檬酸菌(Citrobacter intermedius)、弗氏檸檬酸菌(Citrobacter freundii)以及嗜熱菌Symbiobacterium thermophilum和Symbiobacterium toebii等［2］。近年來，來源于上述微生物的 TPL，其空間結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制已得到較深入研究，并在工業(yè)化應(yīng)用方面取得重要進(jìn)展。

1 TPL的結(jié)構(gòu)特征

1.1 氨基酸組成

C.freundii MT－10419 TPL 的結(jié)構(gòu)基因長 1 368 bp，編碼由456個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，與輔酶結(jié)合的氨基酸殘基是Lys257。E.intermedia FKU10N 和 E.herbicola AJ 2982 TPL同樣由456個氨基酸殘基組成，亞基相對分子質(zhì)量(Mr)分別為51 441和51 364，氨基酸序列同源性為90.6%。Lee等［3］報(bào)道，S.thermophilum 和 Symbiobacterium SP.SC－1 TPL由458個氨基酸殘基組成，結(jié)構(gòu)基因長1 374 bp，與輔酶結(jié)合的氨基酸殘基為Lys258，亞基Mr分別為52 269和52 196，氨基酸序列同源性為99.3%。

1.2 輔酶和單價(jià)陽離子結(jié)合位點(diǎn)

TPL由4個相同的亞基組成。Demidkina等［4］將每個亞基分成N－末端臂、小結(jié)構(gòu)域、大結(jié)構(gòu)域及結(jié)構(gòu)域間的連接區(qū)等四個部分。TPL的催化活性需要磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)作為輔因子。每個亞基含有1個PLP結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于一個亞基大、小結(jié)構(gòu)域與結(jié)晶學(xué)相關(guān)的另一亞基大結(jié)構(gòu)域之間形成的深裂內(nèi)。TPL的催化活性還需要單價(jià)陽離子K+或NH4+作為激活劑。每個亞基含有1個K+結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于結(jié)晶學(xué)相關(guān)的二個亞基之間相聯(lián)系的界面上，具有穩(wěn)定催化二聚體的作用。K+的配位數(shù)為7，它們是一個亞基Gly52和Asn262的羧基氧、另一個結(jié)晶學(xué)相關(guān)亞基Glu69的主鏈羧基氧與側(cè)鏈羧基氧，以及三分子水。Phillips等［5］認(rèn)為，Lys256 緊鄰 PLP 結(jié)合位點(diǎn) Lys257，在單價(jià)陽離子結(jié)合位點(diǎn)的形成中具有關(guān)鍵作用。不同陽離子與配位體在距離上的微小差異，引起了活性部位構(gòu)象的細(xì)微改變，這可能是不同陽離子對TPL活性具有不同效應(yīng)的原因。

1.3 不同pH條件下的構(gòu)象變化

TPL催化L－酪氨酸裂解的最適 pH為8.2，pH 6.0時該酶基本沒有活性。一般認(rèn)為這種高、低pH情況下的酶活差異是由于p K a約為7.8的二種催化堿的質(zhì)子化引起的。Milic等［6］將晶體分別生長于 pH 6.0 和8.0 所得的 C.freundii脫輔基TPL結(jié)構(gòu)比較研究表明，pH 6.0時酶活的顯著降低可能是由于活性部位氨基酸殘基Tyr71、Arg381和Tyr291以及單價(jià)陽離子結(jié)合殘基Glu69的構(gòu)象變化引起的。pH 6.0時脫輔基TPL活性部位呈開放構(gòu)象，pH 8.0時卻存在開放和閉合二種構(gòu)象。相對于開放構(gòu)象，閉合構(gòu)象中的小結(jié)構(gòu)域剛性區(qū)域呈16°旋轉(zhuǎn)向大結(jié)構(gòu)域移動12?，致使小剛性區(qū)域 Phe36、Met391、Arg381、Arg404、Phe448 和 Phe449 的位置和構(gòu)象發(fā)生變化，從而關(guān)閉了活性部位裂。

2 TPL的作用機(jī)理

TPL催化的β－消除反應(yīng)機(jī)制主要包括以下步驟:酶活性部位Lys257的ε－氨基與PLP共價(jià)結(jié)合形成內(nèi)醛亞胺，內(nèi)醛亞胺與底物L(fēng)－酪氨酸作用形成外醛亞胺，Lys257奪取外醛亞胺(底物)Cα質(zhì)子產(chǎn)生醌型中間物，經(jīng)底物Cγ質(zhì)子化及Cβ－Cγ鍵斷裂生成α－氨基丙烯酸中間物，α－氨基丙烯酸中間物進(jìn)一步受與PLP結(jié)合的Lys257ε－氨基攻擊再生TPL全酶［7］。

醌型中間物和Cβ－Cγ鍵斷裂是TPL催化β－消除反應(yīng)的中心和關(guān)鍵。醌型中間物相當(dāng)不穩(wěn)定，難以觀察其結(jié)構(gòu)及反應(yīng)過程中的構(gòu)象變化。Phillips等［8］用快速掃描停流分光光度法(rapid－scanning stopped－flow spectrophotometric method)，在C.freundii TPL催化以 S－乙基－L－半胱氨酸為底物的反應(yīng)中，添加能選擇性結(jié)合并穩(wěn)定醌型中間物的苯酚類似物4－羥基吡啶(5 mmol/L)，首次發(fā)現(xiàn)在338 nm處呈指示醌型中間物的新吸收峰。Milic等［9］對 C.freundii TPL催化以 L－甲硫氨酸為底物所形成的醌型中間物結(jié)構(gòu)及機(jī)制研究表明，TPL活性部位的部分閉合可能發(fā)生于外醛亞胺形成時期，而完全閉合發(fā)生于醌型中間物形成期間或隨后?；钚圆课坏拈]合可保護(hù)醌型中間物免于溶劑影響，而且能將具有重要催化作用的Arg381和Thr124移至合適位置，以便與醌型中間物和過渡態(tài)相互作用，進(jìn)而有利于酮－醌型中間物的形成以及隨后的苯酚消除。

隨后，Milic等［10］對捕捉到的 Cβ－Cγ鍵斷裂前后中間物結(jié)晶快相(crystallographic snapshots)研究時發(fā)現(xiàn)，活性部位處于開放構(gòu)象時醌型中間物呈松弛態(tài)(relaxed)，活性部位閉合時醌型中間物被誘導(dǎo)而呈應(yīng)變態(tài)(strained)，應(yīng)變態(tài)結(jié)構(gòu)主要依靠底物的酚羥基與Arg381、Thr124之間形成的氫鍵來維持穩(wěn)定。為了釋放這種緊張，應(yīng)變態(tài)醌型中間物更易于Cγ質(zhì)子化和Cβ－Cγ鍵的斷裂。Milic等推測，TPL催化的β－消除反應(yīng)后階段步驟，即酮－醌型中間物的形成及隨后的苯酚消除，不僅發(fā)生于閉合的活性部位內(nèi)，而且醌型中間物受活性部位閉合的誘導(dǎo)發(fā)生應(yīng)變而有利于反應(yīng)的進(jìn)行。而且，在Cβ－Cγ鍵斷裂之后，活性部位又呈開放構(gòu)象，以便產(chǎn)物的釋放及與新的底物分子結(jié)合。因此，活性部位的閉合對于TPL發(fā)揮其催化活性具有關(guān)鍵作用。

3 TPL在L-酪氨酸酶法合成中的應(yīng)用

TPL可用于生產(chǎn)L－多巴、L－酪氨酸及其衍生物。日本味之素(Ajinomoto)公司于1993年首先采用TPL生產(chǎn)L－多巴，其工藝是以E.herbicola TPL催化鄰苯二酚、丙酮酸和氨合成L－多巴，可積累 L－多巴110 g/L，并生產(chǎn)出將近世界年產(chǎn)量(250 噸)一半的 L－多巴［11］。但是，這一工藝需在E.herbicola的培養(yǎng)基中添加L－酪氨酸以誘導(dǎo)表達(dá)TPL，而L－酪氨酸和L－多巴理化性質(zhì)相近，從而造成分離純化困難和生產(chǎn)成本增加［12］。相關(guān)的重要進(jìn)展是 Koyanagi等［13］應(yīng)用 DNA改組技術(shù)篩選出攜帶突變型調(diào)節(jié)基因 TyrR的E.herbicola，其TPL在無L－酪氨酸誘導(dǎo)時可積累L－多巴11.1 g/(L·h)，而野生型TPL在有L－酪氨酸誘導(dǎo)時僅為0.375 g/(L·h)，生產(chǎn)率提高了30倍。用TPL生產(chǎn)L－多巴已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化20年，而用TPL合成L－酪氨酸尚處于研發(fā)中。

3.1 用TPL合成L－酪氨酸的工藝路線

L－酪氨酸是目前仍采用酸水解法生產(chǎn)的少數(shù)氨基酸之一，收率低，環(huán)境污染嚴(yán)重，應(yīng)用酶法取代水解法生產(chǎn)L－酪氨酸具有重要的應(yīng)用價(jià)值。用TPL合成L－酪氨酸，首先開展的工藝是丙酮酸路線。Para等將包埋于聚丙烯酰胺凝膠中的C.intermiedius固定化細(xì)胞作為催化劑，分批添加底物，建立75 mmol/L丙酮酸鈉、45 mmol/L硫酸銨、45 mmol/L氯化銨和55 mmol/L苯酚的轉(zhuǎn)化體系，反應(yīng)5 h后可積累L－酪氨酸10 g/L。若將反應(yīng)體系置于連續(xù)的柱反應(yīng)器內(nèi)，苯酚對L－酪氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)90%，且穩(wěn)定性可維持5 d。其次是L－絲氨酸路線。由于L－絲氨酸可通過絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.1.2.1)催化甘氨酸和甲醛廉價(jià)制備，Lee等用產(chǎn)氣克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)和E.herbicola ATCC 21434分別作為絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶和TPL的酶源，將以甘氨酸為底物合成L－絲氨酸的反應(yīng)和以L－絲氨酸為底物合成L－酪氨酸的反應(yīng)相偶聯(lián)，反應(yīng)體系含甘氨酸0.25 mol/L、PLP 0.5 mmol/L、四氫葉酸0.7 mmol/L、初始苯酚濃度0.32%，以37%甲醛啟動反應(yīng)16 h后，可產(chǎn)生L－酪氨酸26.3 g/L，甘氨酸轉(zhuǎn)化率為61.4%，但該工藝存在甘氨酸對TPL抑制較強(qiáng)和操作復(fù)雜的明顯不足。丙酮酸和L－絲氨酸對TPL均具有較高的Km值，需在反應(yīng)體系中過量加入，不僅導(dǎo)致產(chǎn)率降低，而且引起產(chǎn)物分離困難。S－鄰硝基苯－L－半胱氨酸(SOPC)是TPL適宜的人工底物，其Vmax比生理底物L(fēng)－酪氨酸高三倍，而Km僅為L－酪氨酸的50%。Phillips等以C.freundii ATCC 29063細(xì)胞懸液作為酶源，4 mmol/L SOPC和4 mmol/L苯酚反應(yīng)2 h，苯酚的轉(zhuǎn)化率就達(dá)到70%，而且這一反應(yīng)的最適pH較為寬泛(6.8～9.0)。不過，SOPC價(jià)格較高，從而限制了該工藝的工業(yè)化應(yīng)用［14］。

3.2 用DNA改組技術(shù)提高TPL穩(wěn)定性

上述丙酮酸、L－絲氨酸和SOPC三條工藝，均需添加另一底物苯酚，而苯酚能裂解細(xì)胞壁并使蛋白質(zhì)變性，故在轉(zhuǎn)化反應(yīng)中一般采用固定化細(xì)胞形式和間歇添加方式來維持最低的苯酚濃度，以避免苯酚對TPL的抑制和失活作用。TPL存在于多種微生物體內(nèi)，C.freundii等中溫菌TPL對苯酚的耐受性較差，而嗜熱菌TPL即使在高濃度苯酚條件下仍保持良好的穩(wěn)定性，因此近年來嗜熱菌TPL受到了人們的關(guān)注并對其穩(wěn)定性進(jìn)行了進(jìn)一步研究。Kim等［15］以S.toebii TPL為對象，應(yīng)用DNA改組技術(shù)從2萬個突變型TPL中篩選得到突變型A13V，這種TPL在76℃時仍保留60%催化活性，而野生型TPL下降到20%以下;在3 mol/L尿素情況下能顯示50%催化活性，而野生型TPL幾乎完全失去活性。Rha等［16］也對S.toebii TPL進(jìn)行了隨機(jī)突變和重新裝配并篩選得到7個突變型TPL，其催化活性平均增加了3倍，半失活溫度提高了11.2℃。Kim等［17］應(yīng)用具熱穩(wěn)定和化學(xué)穩(wěn)定的S.toebii TPL粗提液為催化劑，設(shè)計(jì)了一個用于L－酪氨酸合成的流加式反應(yīng)器系統(tǒng)，該系統(tǒng)由1個2.5 L的反應(yīng)器和2個各0.5 L的底物貯罐組成，其中一個貯罐含2.2 mol/L苯酚和2.4 mol/L丙酮酸鈉，另一個貯罐含0.4 mmol/L PLP和4 mol/L氯化銨(pH 8.5)，二貯罐內(nèi)的底物溶液通過蠕動泵連續(xù)地流加到反應(yīng)器中，并在反應(yīng)器的液面上空間充滿氮?dú)庖越档偷孜锏难趸饔?，?jīng)40℃反應(yīng)30 h可積累L－酪氨酸130 g/L，苯酚的轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)94%。

3.3 用TPL合成L－酪氨酸衍生物

氮雜酪氨酸(aza－L－tyrosine)具有重要的潛在藥用價(jià)值，2－氮雜酪氨酸最初是從Streptomyces sp.中分離出的具抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物，3－氮雜酪氨酸也是從毒蘑菇Clitocybe acromelalga中分離出的天然產(chǎn)物。Watkins等［18］用來源于C.freundii的重組 TPL為催化劑，建立100 mmol/L氯化銨、0.162 mmol/L PLP、63 mmol/L 丙酮酸和 20 mmol/L 2－羥基吡啶的350 mL 反應(yīng)體系，pH 8.0 ～ 8.2、25 ℃反應(yīng) 5 d，可得純化的2－氮雜酪氨酸45.3 mg;若用3－羥基吡啶代替2－羥基吡啶，pH 8.8 ～ 9.0、37 ℃反應(yīng) 5 d，可得純化的 3－氮雜酪氨酸36.5 mg。Seisser等［19］為縮短 3－取代酪氨酸衍生物繁瑣的多步化學(xué)合成工藝，應(yīng)用定點(diǎn)突變拓寬C.freundii TPL這種C－C鍵形成酶的底物特異性，以獲得的突變型M379V TPL催化丙酮酸、氨和酚類化合物(鄰甲苯酚、鄰甲氧基苯酚和鄰氯苯酚)合成相應(yīng)的3－甲基、3－甲氧基和3－氯酪氨酸等L－酪氨酸衍生物，不僅只需一步反應(yīng)，而且反應(yīng)完全、無副產(chǎn)物，對映體量大于97%。

4 展望

微生物酶法合成氨基酸，以其反應(yīng)周期短、選擇性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化率高、分離純化容易、所得產(chǎn)物均為L－型以及與環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)而日益受到重視，但天然的酶往往存在酶活不高、穩(wěn)定性不夠等缺陷，一定程度上限制了酶法工藝的推廣應(yīng)用。隨著對TPL結(jié)構(gòu)和功能研究的不斷深入，應(yīng)用定點(diǎn)突變、DNA改組等蛋白質(zhì)工程技術(shù)對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，獲得更高的催化活性和穩(wěn)定性，將進(jìn)一步推動該酶在酶法生產(chǎn)L－酪氨酸及其衍生物中的工業(yè)化應(yīng)用。

［1］Koulikova V V，Zakomirdina L N，Gogoleva O I，et al.Stereospecificity of isotopic exchange of C－a－protons of glycine catalyzed by three PLP－dependent lyases:the unusual case of tyrosine phenollyase［J］.Amino Acids，2011，41(5):1247－1256.

［2］Chandel M，Azmi W.Optimization of process parameters for the production of tyrosine phenol lyase by Citrobacter freundii MTCC 2424［J］.Bioresour Technol，2009，100(5):1840－1846.

［3］Lee SG，Hong SP，Choi Y H，et al.Thermostable tyrosine phenollyase of Symbiobacterium sp.SC－1:gene cloning，sequence determination，and overproduction in Escherichia coli［J］.Protein Expr purif，1997，11(3):263－270.

［4］Demidkina T V，Antson A A，F(xiàn)aleev N G，et al.Spatial structure and the mechanism of tyrosine phenol－lyase and tryptophan indolelyase［J］.Mol Biol(Mosk)，2009，43(2):269－283.

［5］Phillips R S，Chen H Y，Shim D，et al.Role of lysine－256 in Citrobacter freundii tyrosine phenol－lyase in monovalent cation activation［J］.Biochemistry，2004，43(45):14412－14419.

［6］Milic D，Matkovic－Calogovic D，Demidkina T V，et al.Structures of apo and holo tyrosine phenol－lyase reveal a catalytically critical closed conformation and suggest a mechanism for activation by K+ions［J］.Biochemistry，2006，45(24):7544－7552.

［7］Phillips R S，Demidkina T V，F(xiàn)aleev N G.Structure and mechanism of tryptophan indole－lyase and tyrosine phenol－lyase［J］.Biochim Biophy Acta，2003，1647(1－2):167－172.

［8］Phillips R S，Chen H Y，F(xiàn)aleev N G.Aminoacrylate intermediates in the reaction of Citrobacter freundii tyrosine phenol－lyase［J］.Biochemistry，2006，45(31):9575－9583.

［9］Milic D，Demidkina T V，F(xiàn)aleev N G，et al.Insights into the catalytic mechanism of tyrosine phenol－lyase from X－ray structures of quinonoid intermediates［J］.J Biol Chem，2008，283(43):29206－29214.

［10］ Milic D，Demidkina T V，F(xiàn)aleev N G，et al.Crystallographic snapshots of tyrosine phenol－lyase show that substrate strain plays a role in C－C bond cleavage［J］.J Am Chem Soc，2011，133(41):16468－16476.

［11］ Ogawa J，Shimizu S.Industrial microbial enzymes:their discovery by screening and use in large－scale production of useful chemicals in Japan［J］.Current Opinion in Biotechnology，2002，13:367－375.

［12］ Koyanagi T，Katayama T，Suzuki H，et al.Effective production of 3，4－dihydroxyphenyl－L－alanine(L－DOPA)with Erwinia herbicola cells carrying a mutant transcriptional regulator TyrR［J］.J Biotechnol，2005，115(3):303－306.

［13］ Koyanagi T，Katayama T，Suzuki H，et al.Hyperproduction of 3，4－dihydroxyphenyl－L－alanine(L－DOPA)using Erwinia herbicola cells carrying a mutant transcriptional regulator TyrR［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2009，73(5):1221－1223.

［14］ Lutke－Eversloh T，Santos C N，Stephanopoulos G.Perspectives of biotechnological production of L－tyrosine and its applications［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，77(4):751－762.

［15］ Kim JH，Song J J，Kim B G，et al.Enhanced stability of tyrosine phenol－lyase from Symbiobacterium toebii by DNA shuffling［J］.J Microbiol Biotechnol，2004，14(1):153－157.

［16］ Rha E，Kim S，Choi S L，et al.Simultaneous improvement of catalytic activity and thermal stability of tyrosine phenol－lyase by directed evolution［J］.FEBSJ，2009，276(21):6187－6194.

［17］ Kim Y D，Rha E，Choi SL，et al.Development of bioreactor system for L－tyrosine synthesis using thermostable tyrosine phenol lyase［J］.J Microbiol Biotechnol，2007，17(1):116－122.

［18］ Watkins E B，Phillips R S.Enzymatic synthesis of Aza－L－tyrsines［J］.Bioorg Med Chem Lett，2001，11(16):2099－2100.

［19］ Seisser B，Zinkl R，Gruber K，et al.Cutting long syntheses short:access to non－natural tyrosine derivatives employing an engineered tyrosine phenol lyase［J］.Adv Synth Catal，2010，352(4):731－736.

Tyrosine phenol-lyase and its application in enzymatic synthesis of L-tyrosine

WEI Ping－h(huán)e，PENG Jia－ping，Ying Jia
(Applied Enzyme Engineering Technology R＆D Center of Jiangsu，Changzhou Institute of Engineering Technology，Changzhou 213164，China)

TQ464.8

A

1005－1678(2012)05－0695－03

2012－04－06

常州市科技支撐計(jì)劃(CE20115033);江蘇省“六大人才高峰”資助項(xiàng)目

韋平和，男，博士，副教授，從事生物活性物質(zhì)的酶法合成和發(fā)酵制備研究，Tel:0519－86332163，E－mail:phwei@email.czie.net。