固定化細胞轉(zhuǎn)化脫氧胸苷合成2'-脫氧腺苷

劉國生，陳 琳，邢善濤，王建琨，焦 璐，魏 聰

(1.河南師范大學 生命科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453007;2.新鄉(xiāng)拓新生化科技有限公司，河南 新鄉(xiāng)453000)

固定化細胞轉(zhuǎn)化脫氧胸苷合成2'-脫氧腺苷

劉國生1，陳 琳1，邢善濤2，王建琨1，焦 璐1，魏 聰1

(1.河南師范大學 生命科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453007;2.新鄉(xiāng)拓新生化科技有限公司，河南 新鄉(xiāng)453000)

目的 選擇最優(yōu)的載體包埋固定化AEM0957細胞酶促催化脫氧胸苷和腺嘌呤合成脫氧腺苷。方法分別用瓊脂、聚丙烯酰胺、明膠、卡拉膠、海藻酸鈉、聚乙烯醇等6種材料包埋固定細菌AEM0957細胞，以此為催化劑轉(zhuǎn)化脫氧胸苷合成脫氧腺苷。結(jié)果 通過優(yōu)化反應(yīng)條件，聚丙烯酰胺固定化細胞催化脫氧胸苷的轉(zhuǎn)化率可達57%，高于游離細胞反應(yīng)能力，并能多次重復(fù)使用，10次重復(fù)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率仍能夠保持在32%左右。結(jié)論 聚丙烯酰胺在穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)化性能等方面優(yōu)于其它材料，該研究為脫氧腺苷的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了重要基礎(chǔ)。

脫氧腺苷;脫氧胸苷;生物合成;固定化細胞;聚丙烯酰胺

抗病毒藥物如拉米夫定、阿德福韋、替比夫定和恩替卡韋等都屬于核苷類或核苷酸類化合物，其中部分采用化學合成法生產(chǎn)，如已應(yīng)用于臨床的阿糖腺苷、三氮唑核苷等［1］。2-脫氧腺苷(Deoxyadenosine，dA)是一種天然的脫氧核苷，是脫氧核糖核酸DNA的結(jié)構(gòu)片段，被廣泛地應(yīng)用于合成寡聚核苷酸和基因工程的研究中，同時是合成多種抗病毒、抗腫瘤藥物的重要中間體［2-4］?，F(xiàn)在可以采用游離細胞(酶)法轉(zhuǎn)化脫氧胸苷(Deoxythymidine，dT)合成dA［5-7］，但由于游離細胞(酶)進行生物合成中，所制備的細胞或酶一次性使用，造成生產(chǎn)成本很高。采用固定化技術(shù)可克服上述不足。固定化技術(shù)操作連續(xù)及可控、工藝簡便、產(chǎn)物分離更容易，從而可以大幅度降低生產(chǎn)成本。本實驗考察了瓊脂、聚丙烯酰胺、明膠、卡拉膠等多種載體用于固定化AEM0957菌細胞以合成dA，篩選出適宜的載體，通過反應(yīng)條件優(yōu)化提高轉(zhuǎn)化率，降低生產(chǎn)成本，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料

菌種:AEM0957菌株，河南師范大學應(yīng)用與環(huán)境微生物實驗室分離保藏。

試劑dT、腺嘌呤(99.5%)由拓新生化科技有限公司提供;胸腺嘧啶、dA對照品(均為分析純)，Sigma公司(原裝進口);牛肉膏、蛋白胨和酵母膏，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;其它試劑均為分析純。

ZF8型三用紫外分析儀，上?？等A生化儀器制造有限公司;高效液相色譜儀，日本島津公司。

2方法

2.1 酶促轉(zhuǎn)化用菌體細胞的制備

將冷藏備用的AEM0957菌種活化后接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，37℃、180 r/min恒溫振蕩器培養(yǎng)22 h。用高速冷凍離心機4 500 r/min離心收集菌體，所得濕菌體冷藏備用［8］。

2.2 細胞固定化方法

2.2.1 海藻酸鈉固定化細胞 參考文獻［9］進行改進:將4%海藻酸鈉溶液10 mL與菌體細胞2 g混勻，使用6號針頭注射器滴入2%CaCl2溶液中，得到固定化顆粒，4℃靜置固定化4 h，洗滌后備用。

2.2.2 明膠固定化細胞 參考文獻［10］進行改進:將保溫于40℃的10%明膠溶液10 mL與菌體細胞2 g混勻，鋪成2 mm厚的膜，4℃冷卻2 h，切成2 mm3左右的小塊，加入0.5%戊二醛溶液交聯(lián)30 min，10%甲醛溶液通透處理1 h，洗滌后備用。

2.2.3 瓊脂固定化細胞 取瓊脂0.6 g溶于100 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH 7.0)10 mL，菌體細胞2 g溶于磷酸二氫鉀緩沖液中，置于60℃水浴內(nèi)，待兩瓶溫度基本一致后，混合搖勻。倒入培養(yǎng)皿中待其凝固，凝膠切成3 mm3小塊，用緩沖液洗去殘渣待用。

2.2.4 聚丙烯酰胺固定化細胞 參考文獻［11］進行改進:菌體細胞2 g加100 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH 7.0、)13.7 mL 于錐形瓶中，加 62.5% 聚丙烯酰胺單體4.8 mL，3.3%交聯(lián)劑 N-N'-甲撐雙丙烯酰胺4.8 mL、50%β-二甲基氨丙腈催化劑0.4 mL和2.5%過硫酸鉀引發(fā)劑1.6 mL以及2.5%維生素C溶液0.5 mL，攪拌均勻，倒入培養(yǎng)皿，25℃靜置30 min，聚合成凝膠。

2.2.5 卡拉膠包埋 卡拉膠、明膠溶于100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)，37℃與菌體2 g混勻，鋪成1～2 mm厚的膜，凝固后切成小塊，用戊二醛溶液交聯(lián)1 h，10%甲苯處理30 min，抽濾洗凈后置冰箱備用［12］。

2.2.6 聚乙烯醇(PVA)海藻酸鈉固定化細胞10%PVA水溶液10 mL，加入海藻酸鈉0.02 g充分溶解，然后與菌體細胞3 g混勻，使用6號針頭注射器，滴入2%CaCl2的飽和硼酸溶液中，邊滴入邊攪拌，在4℃冰箱固定8 h，甲苯處理水溶液通透處理1 h，清洗備用［13］。

2.3 酶促反應(yīng)體系

生物轉(zhuǎn)化合成dA的反應(yīng)體系:將反應(yīng)底物A和dT與一定量的菌體細胞混合，加入 pH 7.0，60 mmol/L的磷酸鉀緩沖液，在55℃水浴振蕩下進行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)6 h。

2.4 dA的簡易定性定量測定

采用紙色譜-分光光度法［14］:分別取20 mmol/L dA對照品溶液、轉(zhuǎn)化反應(yīng)液2μL點樣于色譜紙上，以正丁醇-異丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)為展開劑進行展開，259 nm紫外光下觀察顯色斑點，將其剪下浸泡于水，用分光光度法測定dA含量。

2.5 dA的HPLC定量測定

色譜柱:Hypersil BDS C18柱(4.6 mm ×250 mm);流動相:甲醇-50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH 6.5)(8∶92);流速:0.9 mL/min;檢測波長:254 nm;進樣量:20 μL。

將不同濃度的標準溶液通過HPLC進行測定，對濃度(Y)與峰面積(X)進行回歸得到回歸方程:Y=0.001 7 X+0.011 9(r=0.998)。將反應(yīng)液離心上清液稀釋100倍后進行HPLC檢測，通過回歸方程算得反應(yīng)液中dA的濃度。

3 結(jié)果

3.1 采用不同載體進行固定化細胞合成dA的轉(zhuǎn)化率及穩(wěn)定性

分別以瓊脂、聚丙烯酰胺、明膠、海藻酸酸鈉、卡拉膠、聚乙烯醇為載體材料制備AEM0957固定化細胞。將固定化細胞加入反應(yīng)體系20 mL:25 mmol/L dT、30 mmol/L腺嘌呤溶于pH 7.0的60 mmol/L磷酸鉀緩沖液，55℃酶促反應(yīng)6 h，檢測反應(yīng)液中產(chǎn)物dA的濃度，并以底物dT為標準計算轉(zhuǎn)化率。dT轉(zhuǎn)化率=dA摩爾濃度/dT起始摩爾濃度。

圖1是3次重復(fù)實驗的結(jié)果。實驗表明，AEM0957細胞用6種載體材料固定化之后，催化反應(yīng)效果不如游離細胞，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率均低于游離細胞，原因是細胞經(jīng)過上述材料包埋后增加了底物擴散并進入細胞及產(chǎn)物透出細胞的難度，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化反應(yīng)速度降低。對比6種載體固定化細胞的酶促反應(yīng)結(jié)果，轉(zhuǎn)化率最高的是海藻酸鈉，轉(zhuǎn)化率是對照的73%，其次是瓊脂、聚丙烯酰胺和卡拉膠，轉(zhuǎn)化率分別是對照的57%，52%和54%，明膠和聚乙烯醇最低，轉(zhuǎn)化率只達到對照的39%和36%。

反應(yīng)過程觀察固定化材料形態(tài)變化，海藻酸鈉包埋材料在上述反應(yīng)體系中很容易重新溶解，原因是反應(yīng)系統(tǒng)中較高濃度的陽離子存在，故其轉(zhuǎn)化率雖然與對照比較接近但不適合作為此類反應(yīng)的固定化材料;瓊脂與卡拉膠反應(yīng)溫度55℃下形狀保持不好并有一定程度的溶解，連續(xù)進行3次轉(zhuǎn)化反應(yīng)后固定化的顆粒形態(tài)被完全破壞，故也不適合此高溫條件下的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。聚乙烯醇、明膠和聚丙烯酰胺的固定化顆粒經(jīng)過多次的轉(zhuǎn)化反應(yīng)形態(tài)保持較好，三者都可以作為該類反應(yīng)的固定化材料?？紤]到聚丙烯酰胺在三者之中轉(zhuǎn)化率最高，進一步以此為材料進行固定化轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件的優(yōu)化。

圖1 6種載體固定化細胞合成dA的轉(zhuǎn)化率比較Fig.1 Comparison of conversion rat for dA synthesis using immobilized cells of 6 kind carriers

3.2 聚丙烯酰胺固定化細胞催化活性的穩(wěn)定性

固定化細胞催化活性的穩(wěn)定性是進行連續(xù)生物合成dA的關(guān)鍵，其穩(wěn)定性越高，可以反復(fù)使用的次數(shù)就越多，成本也隨之降低。將聚丙烯酰胺固定化的AEM0957細胞在上述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下進行dA的轉(zhuǎn)化合成，每次反應(yīng)完成分離固定化材料再加入新的反應(yīng)溶液，如此連續(xù)重復(fù)多次轉(zhuǎn)化反應(yīng)，測定每次反應(yīng)產(chǎn)物的濃度，計算轉(zhuǎn)化率(圖2)。結(jié)果表明，在固定化材料重復(fù)使用過程中，其催化活性在最初的幾次重復(fù)反應(yīng)中下降較快，2～4次重復(fù)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率是初次反應(yīng)的83%，79%和71%，之后其催化活性相對穩(wěn)定并略有降低。表明以聚丙烯酰胺包埋的AEM0957細胞能夠在高溫條件下較長時間保持催化活性，在連續(xù)55℃條件下反應(yīng)60 h，其催化能力仍能保持初始的70%。

3.3 聚丙烯酰胺固定化細胞轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

圖2 聚丙烯酰胺固定化細胞重復(fù)反應(yīng)生成dA的轉(zhuǎn)化率Fig.2 Conversion rat of dA synthesis in iterative reaction using polyacrylamide immobilized cells

以上進行的固定化細胞的轉(zhuǎn)化反應(yīng)是依據(jù)前期游離細胞的最適反應(yīng)條件進行的。當細胞被固定化之后，其適宜的反應(yīng)條件有可能變化，故進行如下單因子實驗進行條件優(yōu)化。

3.3.1 反應(yīng)溫度 其它條件不變，改變轉(zhuǎn)化反應(yīng)的溫度，測定46～64℃范圍內(nèi)聚丙烯酰胺固定化AEM0957細胞的轉(zhuǎn)化能力(圖3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化細胞的最適反應(yīng)溫度為52℃，低于游離細胞的最適反應(yīng)溫度。溫度高于60℃，催化活性迅速降低。

圖3 聚丙烯酰胺固定化細胞合成dA的最適反應(yīng)溫度Fig.3 Optimal reaction temperature of dA synthesis using polyacrylamide immobilized cells

3.3.2 緩沖液pH 其它條件不變，改變轉(zhuǎn)化反應(yīng)緩沖液的pH，測定pH 5.5～8.0范圍內(nèi)聚丙烯酰胺固定化AEM0957細胞的轉(zhuǎn)化能力(圖4)，結(jié)果表明最適反應(yīng)pH為6.5，與游離細胞相比適宜的pH向酸性方向偏移;當反應(yīng)pH高于7.5或低于5.5時，其催化活性迅速下降。

3.3.3 緩沖液濃度 其它條件不變，測定磷酸鹽緩沖液20～300 mmol/L濃度范圍內(nèi)聚丙烯酰胺固定化AEM0957細胞的轉(zhuǎn)化能力(圖5)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺固定化的材料適宜的磷酸鹽緩沖液濃度有很大改變，前期實驗表明，游離細胞適宜于轉(zhuǎn)化反應(yīng)的緩沖液濃度有60～80 mmol/L，固定化之后其最適的緩沖液濃度增加至150 mmol/L，最適濃度增加的原因可能與細胞被高分子材料包埋、材料中細胞局部位置與反應(yīng)液間存在濃度差有關(guān)。進一步增大緩沖液濃度，催化活性受到抑制。

圖4 聚丙烯酰胺固定化細胞合成dA的最適pHFig.4 Optimal pH of dA synthesis using polyacrylamide immobilized cells

圖5 磷酸鹽濃度對聚丙烯酰胺固定化細胞合成dA的影響Fig.5 Effectof reaction phosphate concentrations to dA synthesis using polyacrylamide immobilize cells

3.3.4 固定化細胞濃度 其它條件不變，改變包埋材料中菌體細胞的量，考察對轉(zhuǎn)化率的影響(圖6)。結(jié)果表明，菌體濃度從2.5%增加到10%時轉(zhuǎn)化率也隨之增加，超過10%時，轉(zhuǎn)化率不再有明顯增加。因此細胞的適宜包埋濃度以10%為宜。

圖6 聚丙烯酰胺固定化細胞合成dA的最適菌體濃度Fig.6 Optimal cells concentration of polyacrylamide immobilized cells for dA synthesis

3.3.5 條件優(yōu)化后固定化轉(zhuǎn)化效果 根據(jù)上述單因子實驗，調(diào)整反應(yīng)條件:溫度52℃、pH 6.5、磷酸鹽濃度150 mmol/L、菌細胞量10%，進行dA轉(zhuǎn)化反應(yīng)試驗(圖7)。結(jié)果表明，產(chǎn)物濃度在6 h達到最大值，最高轉(zhuǎn)化率可達58%，是游離細胞反應(yīng)的110%。在此條件下進行多次連續(xù)反應(yīng)(圖8)，第2次反應(yīng)仍保持較高的轉(zhuǎn)化率(55%)，第3次催化效果有明顯下降，之后每次反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率有呈逐漸緩慢下降趨勢，10次反應(yīng)后，其轉(zhuǎn)化率仍高于30%。

圖7 優(yōu)化條件下聚丙烯酰胺固定化細胞合成dA的時間-轉(zhuǎn)化率曲線Fig.7 The t-conversion rate curve of polyacrylamide immobilized cells to synthesize dA in optimal condition

圖8 優(yōu)化條件下聚丙烯酰胺固定化細胞重復(fù)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率變化Fig.8 Change of conversion rate of polyacrylamide immobilized cells in repeat reactions in optimizing condition

4討論

通過海藻酸鈉、聚丙烯酰胺等6種材料固定化AEM0957細胞進行dA生物合成實驗，證明采用聚丙烯酰胺、明膠和聚乙烯醇制備的固定化材料比較適合于該轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件下的dA合成，其中聚丙烯酰胺固定化細胞的轉(zhuǎn)化率最高，通過條件優(yōu)化，其轉(zhuǎn)化率可達57%，重復(fù)進行10次反應(yīng)后仍能夠保持較高的催化活性，轉(zhuǎn)化率在32%左右。本研究細胞固定化材料的篩選及轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件的優(yōu)化為dA的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了重要基礎(chǔ)。

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Synthesis ofβ-2'-deoxyadenosine from β-2'-deoxythym idine by immobilized cells

LIU Guo-sheng1，CHEN Lin1，XING Shan-tao2，WANG Jian-kun1，JIAO Lu1，WEICong1
(1.School of Life Sciences，Henan Normal University，Xinxiang 453007，China;
2.Xinxiang Tuoxin Biochemical and Technology ＆ Science Co.，Ltd.，Xinxiang 453000，China)

Purpose Choose the best carrier of immobilized AEM0957 cell for the enzymatic synthesis of deoxyadenosine from thymidine and adenine.M ethods Agar，polyacrylamide，gelatin，carrageenan，sodium alginate and polyvinyl alcohol were used as immobilization materials to encapsulate bacteria AEM0957 cells，and these immobilized cells were used as catalyst to synthesize 2'-deoxyadenosine from 2'-deoxythymidine.Results By optimizing the reaction conditions，the conversion rat of deoxythymidine catalyzed by immlbilized cellswith polyacrylamide achieved 57%，which was higher than that of by free cells.After 9 batches of repeated reaction，the conversion rate was remained at about 32%.Conclusion Polyacrylamide was better than othermaterials in stability and catalytic efficiency.The study laid an important foundation for the industrial production of deoxyadenosine.

2'-deoxyadenosine;2'-deoxythymidine;biosynthesis;immobilized cells;polyacrylamide

TQ464.6;TQ929

:A

:1005-1678(2012)05-0563-05

2011-12-26

國家科技部科技人員服務(wù)企業(yè)行動項目(2009GJD-00044);河南省教育廳自然科學基金項目(2011B180032)

劉國生，男，博士，教授，從事工業(yè)微生物研究，Tel:15937310368，E-mail:hnliugs@163.com。